автор: Cапрыгин Д.Б., Романов М.Ю. (Российская Ассоциация Медицинской Лабораторной Диагностики, ЗАО "Юнимед год издания: 1999

Представлен перечень миокардиальных маркеров, традиционно используемых в биохимической диагностике ОИМ с 1954 года в течение последних 35 - 40 лет: ЛДГ, АсАТ, КК, ЛДГ/ЛДГ-2, ГБДГ, КК.МВ (активность) и МГ . Дана характеристика их диагностической значимости и приводятся основные факторы, влияющие на этот показатель. Анализируется диагностическая специфичность каждого отдельного теста. Дается подробный список заболеваний и патологических состояний, кроме ОИМ, при которых выявляется повышенная активность (концентрация) вышеуказанных ферментов и МГ. Делается вывод об их ограниченной диагностической специфичности, включая наиболее значимые и специфичные: изофермент КК-МВ, определенный методом электрофореза, колоночной ионообменной хроматографии или иммуноингибирования, а также соотношение ЛДГ-1/ЛДГ-2, тестируемое электрофоретическим методом.

Далее представлен перечень тестов, входящих в современное диагностическое меню. Список содержит два подраздела: основных кардиальных маркеров: тропонин I, тропонин Т, КК-МВ (масса), миоглобин, общая КК, соотношение КК-МВ/МГ, ЛДГ-1 и дополнительных тестов: изоформы изофермента КК-МВ, тяжелые и легкие цепи миозина, гликогенфосфорилаза (ГФ), изофермент ГФ-ВВ, карбоангидраза III; белок, связывающий жирные кислоты, a-актин.

Традиционная диагностическая тест-программа

На протяжении многих лет в диагностике такого тяжелого заболевания как острый инфаркт миокарда (ОИМ) использовали определение сывороточной активности ряда ферментов и изоферментов.

Эти широко известные ферментно-изоферментные показатели (табл.1) составили основу так называемой ферментной или энзимодиагностики инфаркта миокарда [2, 3, 4, 7, 10].

(таблица 1)

 

Благодаря радиоиммуноанализу появилась возможность детекции в сыворотке крови миоглобина (Мг) - внутриклеточного белка миокардиальных клеток, не обладающего ферментной активностью. Мг пополнил спектр диагностически важных биохимических тестов, которые вместе с энзимами стали именовать биохимическими маркерами ОИМ.

Таким образом, к концу 80-х годов сформировалась достаточно очерченная группа биохимических показателей, которую можно обозначить как традиционную или классическую диагностическую тест-программу (диагностическое меню), используемую с целью установления и клинической оценки ОИМ (табл.1).

За более чем 35-летний период (начиная с 1953г.) проведены интенсивные и весьма многочисленные изыскания, касающиеся аналитических, метаболических и клинических аспектов применения кардиальных маркеров в диагностике ОИМ. Подытоживая эти исследования, можно сформулировать несколько основных положений в биохимической диагностике ОИМ [1, 3, 4, 9, 10]:

1. Все традиционные маркеры обладают выраженной диагностической чувствительностью, т.е. их повышенная активность выявляется у преобладающего большинства больных (до 90-98%) с документированным ОИМ. Это обусловлено рядом факторов: а) более высоким уровнем удельной активности (концентрации) на грамм веса ткани сердечной мышцы, относительно других внутриклеточных белков и других макромолекул; б) их абсолютная или преимущественная локализация в цитоплазме кардиомиоцитов; в) отсутствие прочного связывания этих протеинов с мембраной или другими внутриклеточными компонентами.

2. Они могут быть подразделены на ранние индикаторы развивающегося ОИМ (Мг) и более поздние (все ферментно-изоферментные показатели).

3. Диагностическая информативность вышеупомянутых тестов (табл.1) зависит от сроков и частоты их определения в динамике развития ОИМ. Последнее обстоятельство является крайне важным, в оценке их диагностической чувствительности и будет в дальнейшем рассмотрено более детально (II. Стандартизация и протокол исследования). Однако сразу отметим, что однократное исследование миокардиальных маркеров у больных (в первый день) ОИМ, либо в поздние сроки (например, на следующий день после поступления) является неприемлемым и практически полностью обесценивает диагностическую значимость тестов.

4. Критериями диагностической эффективности того или иного маркера является:

а) диапазон диагностической значимости, т.е. период времени, в течение которого определяется повышенный, "патологический" уровень определяемого маркера;

б) "манифестность" проявления патологического значения показателя, т.е. степень его увеличения относительно уровня нормальных значений (как правило, относительно верхней границы этого уровня)

5. Диагностическая ценность тестов также зависит от:

а) выбора аналитического метода их определения;

б) уровня обеспечения контроля качества при проведении их исследований

6. Наиболее "уязвимое" место в биохимической диагностике ОИМ в рамках применения "традиционных" тестов - их неудовлетворительная диагностическая специфичность. Она зависит, в первую очередь, от топической, в данном случае миокардиальной специфичности того или иного белкового маркера.

Если определяемый в крови миокардиальный маркер локализуется также в других, кроме сердечной мышцы, органах или тканях организма, то при их повреждении его концентрация в крови будет возрастать, что может привести к ложноположительным результатам. Вся история аналитической и диагностической разработки новых миокардиальных маркеров - поиск абсолютно специфических тестов.

Учитывая невероятную важность этой проблемы, мы считаем необходимым рассмотреть проблему диагностической специфичности "традиционных" маркеров более детально.

 

Диагностическая специфичность "традиционных" миокардиальных маркеров

АСТ (аспартатаминотрансфераза) и ЛДГ (лактатдегидрогеназа) - высокочувствительные показатели ОИМ. Их уровни значительно возрастают в первые дни острого периода ИМ, что обусловлено высокой удельной активностью (концентрацией) этих энзимов в цитоплазме миокардиальных клеток. АСТ в силу распространенности процессов переаминирования в различных тканях организма, содержится, кроме сердечной мышцы, во многих других органах: печени, мышечной ткани, эритроцитах. Этим объясняется возрастание активности фермента в крови больных с различными заболеваниями, связанными с вовлечением в патологический процесс печени и скелетной мускулатуры (табл.2). Аналогичным образом ЛДГ, из-за содержания в высоких концентрациях в самых разных органах и тканях (печень, скелетная мускулатура, эритроциты, почки и т.д.) также обладает низкой диагностической специфичностью для ОИМ (табл.2). В связи с этим в настоящее время оба теста не используются в биохимической диагностике.

(таблица 2)

КК (креатинкиназа) - специфичный фермент мышечной ткани (скелетная и сердечная мышцы, гладкомышечные клетки). Следует отметить, что в сердечной мышце удельная активность КК несколько ниже, чем в тканях скелетных мышц. Учитывая разницу в объеме скелетной и сердечной мышц можно постулировать высокую частоту гиперферментемии КК при различных видах повреждения скелетной мускулатуры.

Представленный в табл.3 список основных заболеваний и состояний, сопровождающихся повышением сывороточной активности КК, достаточно убедительно свидетельствует о возможных трудностях в интерпретации этого показателя.

(таблица 3)

Важно отметить, что диагностическая значимость КК зависит от метода определения фермента. В настоящее время единственным приемлемым методом анализа каталитической активности энзима является так называемый оптимизированный, активированный (с введением в реакционную среду доноров сульфгидрильных групп) кинетический метод определения.

Соотношение ЛДГ1/ЛДГ2, гидроксибутиратдегидрогеназа.

Исторически, изоферменты ЛДГ (соотношение ЛДГ1/ЛДГ2) - первый миокардиальный маркер с высокой кардиоспецифичностью [1, 2, 3, 6]. Органоспецифичность изоферментов ЛДГ обусловлена их различным процентным соотношением в отдельных органах и тканях. В сердечной мышце превалирует соотношение ЛДГ1>ЛДГ2, тогда как в сыворотке крови ЛДГ2>ЛДГ1. При ОИМ из поврежденных кардиомиоцитов в кровь проступает ЛДГ1>ЛДГ2, что и изменяет соотношение изоэнзимов в сыворотке крови больных.

Классическим методом определения соотношения изоферментов был и остается электрофорез на разных средах (агароза, ацетатцеллюлоза, полиакриламидный гель). Были также использованы и другие методы тестирования ЛДГ: использование в качестве субстрата альфа-гидроксибутирата (гидроксибутиратдегидрогеназа, ГБДГ); имеющего большее сродство к Н-субъединицам изоферментов ЛДГ. Однако этот тест не имеет существенных преимуществ перед общей ЛДГ в плане диагностической специфичности и чувствительности.

Другие методы, основанные на различиях в термостабильности, ионнообменной хроматографии, применении различных ингибиторов так и не нашли широкого распространения в лабораторной практике.

Соотношение ЛДГ1/ЛДГ2 - достаточно диагностически чувствительный тест ОИМ. Коэффициент ЛДГ1/ЛДГ2 начинает возрастать в течение первых 8-12 часов ОИМ и равняется 1 или >1 через 24 часа или позже, сохраняясь в измененном варианте в течение нескольких дней и даже недель. Таким образом, этот тест - поздний маркер заболевания.

Поэтому возрастание первой фракции ЛДГ1 в сыворотке крови при электрофоретических методах исследования, рассматривается как достаточно специфичный диагностический признак заболевания.

К сожалению, кроме миокардиальной ткани определенный уровень ЛДГ1 определяется в эритроцитах и поэтому гемолиз in vivo и in vitro может привести к ложноположительным результатам (табл.4).

Кроме того, некоторая активность ЛДГ1, более чем ЛДГ2 была также детектирована в почках (корковая часть), легких и мозговой ткани. Соответственно, при некоторых заболеваниях, сывороточный уровень ЛДГ1 возрастает (табл.4).

(таблица 4)

Таким образом, наряду с очевидным достоинством (кардиоспецифичность) определение соотношения изоферментов ЛДГ1/ЛДГ2 имеет ряд недостатков:

1. Электрофоретический метод их определения достаточно трудоемок, что ограничивает его применение в срочной диагностике ОИМ. Воспроизводимость этого метода имеет большой коэффициент вариации.

2. Тест не может быть использован в ранней диагностике ОИМ;

3. Из-за высокого уровня ЛДГ1 в эритроцитах велика вероятность получения ложноположительных результатов при гемолизе in vitro и in vivo.

Изофермент КК МВ

Среди традиционных маркеров именно определение активности КК МВ до последнего времени рассматривалось в качестве "золотого стандарта" в биохимической диагностике ОИМ. Действительно, КК МВ, в отличие от общей КК и изофермента КК ММ, в очень высоких концентрациях содержится в сердечных мышцах (15-38% от общей КК) и лишь в незначительных количествах (3-4%) - в миоцитах скелетных мышц [7]. В других органах и тканях (кроме мозговой) изофермент не идентифицируется. Повышение КК МВ у больных с ОИМ является высокоспецифичным и высокочувствительным признаком ОИМ. Однако, как выяснилось в результате длительных исследований, кардиоспецифичность изофермента КК МВ не абсолютна, что, видимо, прежде всего, обусловлено его выходом из поврежденных скелетных мышц (табл.5).

(таблица 5)

Изначальным методом определения изоферментов КК было электрофоретическое исследование, позволяющее осуществить разделение КК на три фракции: КК ММ, КК МВ и КК ВВ [13]. При электрофорезе сыворотки крови здоровых лиц фракция ВВ (мозговой изофермент) отсутствовала, а МВ - определялась лишь в следовых количествах (0 - 2%). Поэтому ее процентное возрастание рассматривалось как выход изофермента из поврежденного (некротизированного) миокарда, признак развивающегося ОИМ. Увеличение этой фракции в сыворотке крови больных выявлялось в течение 4-7 часов после начала заболевания, достигая уровня максимальных значений в пределах 16-26 часов, затем понижалась до базового уровня к 48-72 часам. При определении изофермента КК МВ этим методом было выявлено некоторое число ложно-положительных результатов (табл.5) [7, 12, 13]. Попытка использовать определенный уровень процентного содержания КК МВ относительно общей КК (5-6%), как критерий ОИМ лишь несколько улучшила диагностическую специфичность теста.

Кроме того, на результаты электрофоретического исследования изоферментов сказывалось появление в сыворотке крови больных и даже здоровых людей атипичных изоферментов и изофермента КК ВВ.

Поэтому трудоемкость, неудовлетворительная точность полуколичественного электрофоретического метода, заставили искать иные методические приемы идентификации сывороточной КК МВ. Был предложен, в частности метод разделения изоферментов КК на ионообменных смолах [11]. Однако он требовал для анализа достаточно больших объемов образцы, оставался трудоемким и страдал неудовлетворительной воспроизводимостью.

Начиная с 1966-67 годов в клиническую практику вводится новый метод исследования КК МВ - иммуноингибирование с использованием непреципитирующих антител (антисывороток) и М субъединицам КК [8]. Этот метод, отличающийся хорошей аналитической чувствительностью и воспроизводимостью, простотой исполнения, был реализован на большинстве биохимических анализаторов, и вследствие вышеуказанных характеристик, стал широко применяться в клинико-биохимических исследованиях, вытеснив все предшествующие способы определения КК МВ.

В ходе клинической апробации метода выяснилось, что с учетом соблюдения сроков и частоты исследования активности КК МВ, его диагностическая чувствительность при ОИМ приближается к 100%. Однако, одновременный клинический опыт использования маркера выявил и ряд недостатков, усугубляющих ситуацию с его недостаточной диагностической специфичностью, отчасти связанной с проблемами в аналитической специфичности (отклонения в изоферментном составе КК и образование комплексов), что приводило к ложноположительным результатам (табл.5).

Миоглобин

Основное достоинство этого теста - высокая чувствительность на самых ранних стадиях развития ОИМ. Однако, также как и КК он обладает достаточно низкой диагностической специфичностью, т.к. содержится в относительно высоких концентрациях не только в сердечной, но и во всех скелетных мышцах. Список ложноположительных результатов при определении Мг представлен в табл.6. Так как этот показатель в настоящее время в силу ряда причин широко используется в современных диагностических тест-программах (табл.1) более подробно мы проанализируем его клиническую значимость далее, при их рассмотрении.

(таблица 6)

 

Современная диагностическая тест-программа:

В конце 80-х годов в клинической биохимии произошло событие, которое без сомнения могло быть отнесено к сенсационному - в крови больных ОИМ были обнаружены сократительные белки - тропонины (Тн), которые, как позже выяснилось, оказались практически абсолютно специфичными для миокардиальной ткани.

С тех пор по проблеме диагностической значимости Тн-I и Тн-Т, а также по методическим проблемам их определения в сыворотке крови опубликовано огромное количество работ. В настоящее время эти маркеры являются основными в современном диагностическом меню ведущих медицинских центров (табл.1) и используются в диагностике и оценке не только ОИМ, но и при "неинфарктных" повреждениях сердечной мышцы [6]. Интерпретация результатов изменений в сывороточной концентрации Тн- I и Тн-Т вышла за рамки их диагностического рассмотрения при ОИМ, фактически изменив многие традиционные представления кардиологов о патогенезе и клиническом проявлении ИБС, ряда других сердечно-сосудистых заболеваний, повреждений миокарда при некоторых "некардиальных" состояниях и заболеваниях.

Тесты, которые включены в современное диагностическое меню, включают также определение КК МВ, но не как активности, а как массы, концентрация которой тестируется с помощью иммуноферментных методов, реализованных на большинстве современных иммунохимических анализаторов.

Новое звучание в современной биохимической диагностике приобрело и определение Мг, которое стало значительно более быстрым, точным и современным.

В ряде кардиологических центров, успешно применяющих миокардиальные маркеры в диагностике, ведении и лечении больных с острыми формами ИБС используются и другие тесты: ЛДГ1 (иммунохимический метод), тяжелые и легкие цепи миозина, изоформы изоферментов КК МВ и ММ, карбоангидраза III, гликогенфосфарилаза и ее изоферменты ВВ (табл.1).

В стадии коммерческой разработки и клинической апробации находятся такие новые маркеры, как альфа-актин и белок, связывающий жирные кислоты.

Более подробная аналитическая и клиническая характеристика всех вышеперечисленных тестов, входящих в современное диагностическое меню, а также стандартизованный протокол их исследования, будут обсуждены в следующей части настоящей публикации.

 

ЛИТЕРАТУРА

автор: Cапрыгин Д.Б., Романов М.Ю. (Российская Ассоциация Медицинской Лабораторной Диагностики, ЗАО "Юнимед год издания: 1999