Новая технология для стандартизированного приготовления цитологических препаратов

  Более пятидесяти лет назад доктор Папаниколау, чьим именем впоследствии был назван метод (Рар-тест), разработал метод цитологического исследования клеток цервикального канала по мазку на стекле. Рар-тест широко используется в скрининговых исследованиях для диагностики рака шейки матки, предраковых и фоновых состояний. В странах северной Европы, где хорошо организованы скрининговые исследования, лечение предопухолевых состояний и ранних форм рака позволило уменьшить смертность от инвазивной цервикальной карциномы на 50 - 70 %.  По опубликованным данным, в Финляндии в 1992 г. заболеваемость была снижена до 2,8 случаев на 100000 женщин. В России в 1998 г. было выявлено 11 937 новых случаев заболевания, что составляло 15,3 на 100000 женщин, из которых 6,078 умерло  [9]. В Англии по данным на 1987/88 гг. заболеваемость составляла 9 на 100000 женщин, смертность в 1997 г. – 3,7 на 100000. При этом около 4 млн. женщин в год проходили цитологическое  скрининговое исследование цервикальных мазков [8].  В настоящее время выявление группы риска при цитологическом исследовании цервикальных мазков во время  профилактических осмотров и дальнейшего наблюдения позволяют уловить процесс озлокачествления на самых ранних стадиях. Если рак шейки матки диагностируется на начальной бессимптомной стадии, он практически излечим хирургическими или лучевыми методами.

Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологии клеток в мазке является правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок. Эффективность цитологической диагностики в значительной мере определяется качеством приготовления препаратов. В настоящее время все большее распространение получает новая технология приготовления цитопрепаратов, так называемая жидкостная цитология. Важной технологической особенностью метода жидкостной цитологии (ЖЦ), улучшающей качество исследования, является то, что исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства. Для метода ЖЦ известно несколько систем: AutoCytePrep (CytoRich), Cytoscreen, LABONORD Easy Prep, Thin Prep.

В последние пять лет в разных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и ЖЦ, используя для подтверждения диагнозов гистологическую экспертизу, как «золотой стандарт» и оценку цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System). В исследовании участвовали как поликлинические, так и стационарные отделения, обследовавшие тысячи пациентов [5,6,7,10]. По обобщенным данным чувствительность традиционного метода колеблется в широком диапазоне значений: 34,5 – 89 %; а для метода ЖЦ имеет более стабильные значения: 71,4 – 95 %. Соответственно специфичность методов составляла: 36 – 76,9 % и 58 – 76,2 %. Авторы исследований резюмировали, что метод ЖЦ является более надежным лабораторным тестом, уменьшает количество ложноотрицательных результатов, уменьшает количество неудовлетворительных для анализа препаратов и время, необходимое цитологу для оценки препарата.

Исследование мазков по Папаниколау, полученных традиционным методом сбора материала, показывает, что не все, а только от 6,5 до 18 % взятых клеток наносятся на мазок. Кроме того, многие из этих клеток в результате плохого нанесения трудно или невозможно анализировать [5]. Не вызывает сомнения, что традиционный метод анализа цитологического мазка имеет высокую диагностическую эффективность. Тем не менее, существует мнение, что метод имеет от 6 до 55 % ложноотрицательных результатов. По данным обзора Fahey чувствительность традиционного метода составляет 55-65 %, а специфичность -  65-70 % [4].

 

Причиной большинства (около 2/3) ложных результатов, снижающей  качество работы лаборатории, является ошибка взятия или переноса материала для приготовления мазков. Материал  для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок  клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. Материал может быть неравномерно распределен на стекле. Слишком толстый мазок является причиной получения неполноценного материала. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки целого региона цервикса могут не попасть в препарат. Подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно уменьшает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод ЖЦ позволяет исключить эти негативные факторы.

В данной статье представлена автоматизированная система приготовления тонкослойных цитопрепаратов методом ЖЦ Cytoscreen, которая в отличие от выше перечисленных систем позволяет не только получить качественные тонкослойные цитопрепараты,  но и стандартизировать процедуру их приготовления, что в дальнейшем обеспечивает правильную трактовку цитологической картины. Система является универсальной, но наиболее широко используется для приготовления цервикальных мазков.

Для эффективного анализа материал для приготовления традиционных мазков, так же как и для метода ЖЦ, должен забираться из экто- и эндоцервикса. Система включает специальный инструмент для взятия гинекологического материала – пластиковые щетки-кисточки, которые, в отличие от распространенных шпателей,  предотвращают потерю и высыхание клеток. Щетки Cytoprep обеспечивают получение полноценного материала, охватывая нужные зоны, и являются первым инструментом, специально разработанным для метода ЖЦ. Полноценным материалом считается мазок хорошего качества, содержащий клетки плоского эпителия, клетки эндоцервикса и метаплазированные клетки [3].

Если мазки будут окрашены по методу Папаниколау, их необходимо максимально быстро после получения зафиксировать влажными с помощью специального аэрозоля или капельным фиксатором. Без влажной фиксации клетки могут морфологически измениться при высыхании мазка. Стабилизирующий раствор Cytoscreen, предотвращающий преждевременное высыхание клеток. был разработан по результатам исследовательской работы, продолжавшейся более шести лет, в течение которых было проанализировано около 10 тысяч цитологических мазков. Стабилизирующий раствор хранится  вместе с исследуемым материалом или без него в течение 24 месяцев. Раствор устойчив к высокой и низкой температуре.

Использование технологии ЖЦ позволяет снизить число ложных результатов во многом благодаря комбинированному использованию стабилизирующего раствора и специального инструмента для взятия материала щеточки Cytoprep. Быстрое консервирование материала позволяет предотвратить бактериальное засорение образца, повреждение клеток вследствие их высыхания, сохраняет образец в оптимальных условиях для дальнейшей его транспортировки в лабораторию и исследования.  Полученные препараты можно успешно использовать для проведения молекулярно-биологических исследований. Возможно проведение HPV (Human papiloma virus) – теста на выявление вируса папилломы человека. Выявлению HPV придают большое значение в противораковом скрининге [9].

Еще одним важным этапом приготовления цито-препарата с помощью представленной системы является использование нефелометра, позволяющего классифицировать образцы в зависимости от концентрации суспензии. Нефелометр позволяет немедленно определить плотность клеточной взвеси, которая пропорциональна количеству клеток в образце, и дифференцировать образцы по группам. Для дальнейшего приготовления тонкослойного препарата указанное количество клеточной суспензии берется в цито-камеру соответственно классу клеточности. Таким образом, процедура приготовления препарата включает получение стабилизированной гомогенной суспензии, оценку плотности клеточной суспензии на нефелометре, центрифугирование  цитокамеры. В результате стандартизованной процедуры выполнения получаются препараты, в которых клетки располагаются равномерным монослоем, в отличие от обычных препаратов, с неравномерным распределением и окрашиванием материала. Технология позволяет формировать на одном предметном стекле несколько полей зрения.

Cytoscreen - это универсальная система, которая может быть использована как для приготовления цитологических микропрепаратов в гинекологии, так и для исследования другого биологического материала: для цитологического исследования мочи, различных биологических жидкостей, исследование мокроты, бронхиальных смывов, соскобов, материала  тонкоигольной биопсии. Это наиболее простой метод приготовления мазков высокого качества при небольших затратах [2].

Монослойные цитологические препараты позволяют применять цитологическую диагностику по видеоизображениям с использованием телекоммуникаций, использовать компьютерные технологии в оценке результата анализа.

Стандартизация в цитологии остается на сегодняшний день важной и трудной проблемой. Лабораторные цитологические методы имеют свои особенности, являясь преимущественно морфологическими методами, которые в отличие от классических лабораторных методов носят описательный характер. Качество цитологического анализа зависит от многих факторов; в их числе способ получения материала, локализация патологического очага, особенности гистологического строения опухоли, метод исследования. Кроме того, установление цитологического диагноза зависит от субъективного фактора: квалификация и практический опыт цитолога, способность оценить различные цитологические признаки [1]. Эффективность цитологической диагностики, помимо квалификации врача, в значительной мере определяется качеством приготовления препаратов.

Конечно, внедрение новой технологии в клинико-диагностические лаборатории требует определенных финансовых затрат и не может уменьшить заболеваемость женщин цервикальным раком, но улучшая качество диагностики массовых исследований, помогает снизить смертность от данного заболевания.

 

Литература:

1.        Качество клинических лабораторных исследований. (под редакцией Меньшикова В.В.) Москва 2002 г.

2.        Самсонова М.В., Черняев А.Л. Стандартные цитопрепараты бронхоальвеолярного лаважа в исследовании патологии легких. Лаборатория; 1997, №6, 7-9.

3.        Шабалова И.П.. Цитологический атлас. Критерии диагностики заболеваний шейки матки. Москва, 2001 г.

4.        Fahey MT, Irwig L, Macaskill P. Meta-anallysis of Pap test accuracy// American Journal of Epidemiology. - 1995. – v. 141:- p. 680-689.

5.        Grace A, McBrearty P, Troost S, Thornhill M, Kay E, Leader M. Comparative study: conventional cervical and ThinPrep Pap tests in routine clinical setting// Cytopatology.- 2002. –v.13(4). – p.200-205.

6.        Lee K., Ashfaq R., Birdsong G., et.al. Сomparison of conventional Papanicolaou smears and a fluid-based, thin-layer system for cervical cancer screening// Obstet Gynecol. -1997 .-v.90. – p.278-284.

7.        Monsonego J, Autillo-Touati A, Bergeron C, et al. Liquid-based cytology for primary cervical cancer’screening: a multi-centre study//  Br J Cancer. – 2001. – v. 84. – p. 360-366.

8.        Payne N, Chilcott J, McGoogan E. Liquid-based cytology in cervical screening. A report by the School of Health and Related Research, the University of Sheffield. January 2000.

9.        Syrjänen S., Shabalova I.,  Petrovichev N. et al. Human Papillomavirus Testing and conventional Pap smear cytology as optional screening tools of women at different risks for cervical cancer in the countries of the former Soviet Union// J Lower Genital Tract Disease. – 2002. - v.6. – p. 97-110.L

10.     Wang T., Chen H., Yang Y., Tsou M. Comparison of fluid-based, thin-layer processing and conventional Papanicolaou methods for uterine cervical cytology// J Formos Med Assoc. - 1999 .-v.98. – p.500-505.

 

 

 

 

 

Рис 1. Цитологический препарат, полученный традиционным методом (А) и по технологии Cytoscreen (Б). Предоставлен кафедрой клинической лабораторной диагностики РМАПО.