Методы определения холестерина липопротеидов низкой плотности

 

 

В настоящее время можно считать доказанным, что увеличение концентрации холестерина (ХС) в крови и в липопротеидах низкой плотности (ЛПНП), а также снижение ХС в ЛП высокой плотности (ЛПВП) являются факторами риска атеросклероза. Классификация гиперхолестеринемий, отражающая связь уровня ХС и риск ИБС впервые представлена в конце 80+х годов экспертными группами Национальной образовательной программы по холестерину в США (National Cholesterol Education Program, NCEP) и Европейского общества по изучению атеросклероза [9, 13]. В 2001 году опубликован третий доклад экспертов NCEP, посвященный выявлению, оценке и терапии высокого уровня холестерина у взрослых (Adult Treatment Panel III, ATP III) [6]. Основным отличием АТР III от предыдущих докладов [9, 10] является определение риска ИБС по уровню ХС ЛПНП, а не общего ХС сыворотки крови. В этой связи определение уровня ХС ЛПНП требует особого внимания специалистов лабораторной диагностики [2, 3].

ЛПНП у человека содержат большую часть циркулирующего ХС (65–75%) и транспортируют его к периферическим тканям для формирования мембран и процессов стероидогенеза. Основным и практически единственным видом аполипопротеинов (апо) в составе ЛПНП является апо В-100, каждая частица ЛПНП содержит только одну молекулу. Период полужизни циркулирующих ЛПНП у здоровых людей составляет приблизительно 2,5 дня [1].

У здоровых людей практически все ЛПНП образуются в сосудистом русле в результате преобразования другого класса ЛП частиц – липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП). Крупные частицы ЛПОНП, содержащие эндогенные липиды и апо В-100, образуются в клетках печени и после поступления в кровяное русло подвергаются превращениям, в результате которых образуются ЛП меньших размеров и большей плотности – ЛПНП. Такое изменение обусловлено гидролизом большей части триглицеридов (ТГ) ЛПОНП под действием двух липолитических ферментов гепаринзависимой липопротеидлипазы и печеночной триглицеридлипазы [1, 4].

В 70-х годах работами американских ученых M. Brown и J. Goldstein показано наличие специфических рецепторов к ЛПНП на поверхности клеток. Лигандами рецептора являются апо В+100 и апо Е. ЛПНП взаимодействуют с рецепторами на мембране клеток печени, надпочечников и периферических тканей, включая клетки гладкой мускулатуры и фибробласты. Печень является основным местом рецептор-опосредованного катаболизма: гепатоциты захватывают примерно половину частиц ЛПНП; оставшаяся часть ЛПНП распределяется между другими тканями.

После взаимодействия с рецептором частицы подвергаются эндоцитозу, и компоненты ЛПНП катаболизируются в лизосомах. Скорость синтеза ХС в клетке и синтез

апо В,Е-(ЛПНП)-рецепторов на мембране клетки регулируется по принципу обратной связи, т.е. количество рецепторов на клеточной мембране зависит от содержание ХС в клетке.

В норме рецепторным путем метаболизируются до 80% общего количества ЛПНП, оставшиеся частицы включаются в клетки периферических тканей за счет неспецифического эндоцитоза, который, в отличие от специфического эндоцитоза при участии В,Е-рецепторов, не регулируется механизмом обратной связи. При увеличении концентрации ЛПНП в кровотоке интенсивность неспецифического эндоцитоза возрастает. В катаболизме

ЛПНП определенную роль играют и скевенджер-рецепторы, которые представлены на тканевых макрофагах, трансформированных гладкомышечных клетках и на клетках, обладающих макрофагальными свойствами, в том числе на Купфферовских клетках печени. Захват ЛПНП макрофагами сопровождается увеличением ХС в клетке и часто трансформацией макрофагальной клетки в пенистую, способствуя формированию атеросклеротической бляшки. Взаимодействие со скевенджер-рецепторами имеет место и при нормальной концентрации ЛПНП, но существенно усиливается при повышении их

концентрации и задержке ЛП частиц в кровотоке.

В клинической биохимии уровень ЛПНП в плазме крови оценивают по содержанию в них ХС. Референсный метод определения ХС ЛПНП является многостадийным: 1) ультрацентрифугирование в плотности 1,006 г/мл при 105 000g в течение 18 часов для удаления ЛП, богатых ТГ (ХМ и ЛПОНП); 2) выделение донной фракции (плотности 1,006 г/мл) и прецитипация в ней ЛП, содержащих апо+В смесью гепаринMnCl₂ для выделения ЛПВП; 3) определение концентрации ХС в донной фракции и супернатанте референсным методом для определения общего ХС (модифицированный метод Абеля-Кендалла) 4) вычисление ХС ЛПНП как разности для значений ХС в донной фракции и ХС ЛПВП [5].

Препаративное выделение методом ультрацентрифугирования в солевом растворе определенной плотности позволяет изолировать ЛПНП и определить их состав.

Длительность и трудоемкость ультрацентрифугирования привела к разработке методов, более доступных для лабораторной практики. Самым распространенным способом

определения ХС ЛПНП в клинических лабораториях является расчетный [12]. В этом случае необходимо определить концентрацию ХС и ТГ в сыворотке крови и концентрацию ХС ЛПВП в супернатанте после преципитации ЛП, содержащих апо В (ЛПОНП и ЛПНП), и вычислить значение концентрации ХС ЛПНП по формуле Фридвальда [7]:

 

* – ХС ЛПОНП

 

В основе этой формулы лежат два допущения: 1) большая часть ТГ плазмы находится в ЛПОНП; 2) весовое отношение ТГ/ХС в ЛПОНП равно 5:1.

Формула Фридвальда позволяет получить значения ХС ЛПНП, сопоставимые с полученными референсным методом при ТГ < 2000 мг/л, при концентрации 2000–4000 мг/л

доля правильных результатов снижается. Применение этой формулы при концентрации ТГ > 4000 мг/л, наличии ХМ, III типе гиперлипопротеидемии (ГЛП) приводит к завышению содержания ХС ЛПОНП и занижению ХС ЛПНП и не позволяет получить сопоставимые результаты [11, 12].

Методы преципитации были первой попыткой разработки прямых методов выделения ЛПНП, пригодных для использования в клинико+диагностической лаборатории.

Преципитационные методы выполняются в несколько этапов. Первый – осаждение ЛПНП после добавления преципитирующего агента (гепарин, поливинилсульфат, неспецифические амфипатические полимеры, декстрансульфат), второй – центрифугирование для разделения

осадка и надосадочной жидкости (супернатанта), третий – определение концентрации ХС в супернатанте, четвертый – расчет ХС ЛПНП как разности общего ХС и ХС

в супернатанте.

Методы не имеют преимуществ перед расчетным: концентрация ТГ > 400 мг/дл, наличии ХМ или III типа ГЛП ограничивает их применение, в этих случаях имеет место копреципитация ЛПОНП и особенно их ремнантов [11].

Гомогенные методы определения ХС ЛПНП основаны на использовании различных детергентов и других химических соединений, способных специфично блокировать или солюбилизировать классы ЛП для выделения ЛПНП. ХС ЛПНП определяют ферментативным методом в той же кювете.

Метод солюбилизации. В присутствии МgCL2 α-циклодекстрин блокирует ХС в составе ЛПОНП и ХМ. Полиоксиэтилен-полипропилен (POE+POP) блокирует ХС в составе ЛПВП. В реакцию с ферментами в присутствии хромогенов вступает только ХС ЛПНП; в результате образуется окрашенный продукт, оптическая плотность которого при 546 нм пропорциональна концентрации ХС ЛПНП в пробе.

Метод с применением сурфактантов. Детергент 1 солюбилизирует ЛП всех классов, кроме ЛПНП (ЛПВП, ЛПОНП, ХМ). Образованная при взаимодействии с ферментами перекись водорода разрушается пероксидазой, окрашивания нет. Детергент 2 освобождает ХС из частиц ЛПНП, после реакции с ферментами в присутствии хромогенов образуется окрашенный продукт, оптическая плотность которого при 546 нм пропорциональна концентрации ХС ЛПНП в пробе.

Метод с применением защитного реагента. Амфотерный сурфактант (защитный реагент) селективно защищает ЛПНП от действия ферментов. ХС остальных классов ЛП

(ЛПВП, ЛПОНП, ХМ) при взаимодействии с ферментами образуют перекись водорода, которая разрушается под действием каталазы. Неионный сурфактант освобождает ЛПНП от защиты, ХС ЛПНП вступает в реакцию с ферментами в присутствии хромогенов с образованием окрашенного продукта.

Каталазный метод. В присутствии смеси неионных сурфактантов ХС всех классов ЛП, кроме ЛПНП (ЛПВП, ЛПОНП, ХМ), вступает в реакцию с ферментами, образованная перекись водорода удаляется при действии каталазы. После 5 мин. инкубации действие каталазы блокируется добавлением азида Na, и в присутствии Тритона Х-100 ХС ЛПНП вступает в реакцию с ферментами в присутствии хромогенов с образованием окрашенного продукта.

Метод с использованием каликсарена. Детергент 1 (каликсарен) образует с ЛПНП растворимый комплекс. Все ЛП кроме ЛПНП (ЛПВП, ЛПОНП, ХМ) вступают в реакцию с ферментами и гидразином с образованием холестенон-гидразона. Детергент 2 (деоксихолат) разрушает комплекс ЛПНП - детергент 1 и ХС ЛПНП вступает в реакцию с ферментами в присутствии β-НАД с образованием β-НАДН, концентрация которого измеряется спектрометрически.

Проведенные исследования показали, что все предложенные «гомогенные» методы определения ХС ЛПНП обладают высокой чувствительностью и специфичностью,

линейностью в необходимых пределах, прекрасной воспроизводимостью [11, 12]. Результаты определения незначительно подвержены влиянию повышенной концентрации гемоглобина, билирубина и триглицеридов. Однако при использовании ряда методов отмечают влияние на результаты диспротеинемий и парапротеинемий [11].

Согласно рекомендациям Национальной образовательной программы по холестерину, метод определения ХС ЛПНП должен удовлетворять определенным критериям правильности и воспроизводимости [5]. Коэффициент вариации (КВ_ан) между сериями (случайная ошибка) должен быть ≤ 4%; среднее отклонение от значений ХС ЛПНП, выполненных референсным методом (систематическая ошибка, О_с), не должно превышать 4%. Общая ошибка

(О_об) при измерениях, рассчитываемая как сумма систематической и случайной ошибок, О_об = 1,96 . КВ_ан + О_с, должна быть < 12%.

Преимуществами гомогенных методов являются полная автоматизация исследования, позволяющая достичь необходимого уровня воспроизводимости при определении ХС ЛПНП. Однако данные, полученные гомогенными методами, не всегда удовлетворяют критериям правильности вследствие систематической ошибки – завышения или занижения онцентрации ХС ЛПНП в сравнении со значениями, полученными референсным методом. Тем не менее, благодаря низким значениям КВ, эти методы удовлетворяют критериям NCEP для определения ХС ЛПНП – суммарная ошибка измерений не превышает 12%.

Таким образом, для определения ХС ЛПНП в клинико+диагностических лабораториях используется множество методов, основанных на разных принципах. В этой связи особое значение при определении ХС ЛПНП приобретает качество калибровочных материалов. В зависимости от метода, при определении ХС ЛПНП используют калибровочный материал для определения ХС или ХС ЛПНП.

Калибровочный материал для определения ХС может быть представлен водным раствором ХС или водным раствором ХС с добавлением матрицы (белка), калибровочной сывороткой. Предпочтительным является использование калибровочного материала, значения которого определены референсным методом и обеспечена прослеживаемость до аттестованного (сертифицированного) первичного стандартного образца (референсного материала) [5, 11].

Концентрация первичного референсного материала определяется дефинитным методом (изотопное разведение, газовая хроматография/масс+спектрометрия), концентрация вторичных референсных материалов, используемых для калибровки ферментативных методов – референсным методом (модифицированный метод Абеля-Кендалла). Метод включает эстракцию липидов неполярным растворителем, химический гидролиз эфиров ХС

(омыление) спиртовым раствором KOH, развитие окрашивания после добавления реактива Либермана-Бурхарда (уксусный ангидрид-уксусная кислота-серная кислота).

Референсный метод относится к химическим непрямым (экстракционным) методам определения ХС и является трехстадийным [8].

Как и при определении ХС, при определении ХС ЛПНП предпочтительным является использование калибровочного материала, значения которого определены референсным методом и обеспечена прослеживаемость до аттестованного (сертифицированного) первичного стандартного образца.

Современная лабораторная диагностика предлагает широкий спектр методов и методических приемов для определения ХС ЛПНП, различающихся не только по аналитическим свойствам, но также по трудоемкости и стоимости.

В этой связи при выборе метода для определения ХС ЛПНП, руководствуясь задачами исследования, следует учесть все достоинства и недостатки предлагаемых методов

и главное, не забывать одно из основных правил лабораторной диагностики нарушений липидного обмена: выполнение анализов всех пациентов, включенных в программу,

должно быть проведено одним методическим приемом.

 

 

1. Климов А., Никульчева Н. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. – С+Пб: «Питер», 1999. – 512 с.

2. Творогова М.Г. Лабораторная диагностика нарушений липидного обмена//Лабораторная медицина. – 2001. – №4. – с.67–74.

3. Творогова М.Г. Диагностически значимые уровни холестерина в сыворотке крови: современная точка зрения//Лабораторная медицина. – 2002. – №5. – с. 20–23

4. Творогова М.Г. Аполипопротеины – свойства, методы определения, клиническая значимость//Лабораторная медицина. – 2005. – №7. – с. 29–37.

5. Bachorik P., Ross J. National Cholesterol Education program recommendations for measurements of low+density lipoprotein cholesterol: executive summary. National Cholesterol Education

program Working Group on lipoprotein Measurements// Clin Chem. – 1995. – v.41. – p.1414–1420.

6. Expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholestrol in adults/ Executive summary of the third report of the National Cholesterol Education program (NCEP) expert panel on

detection, evaluation and treatment of high blood cholestrol in adults (Adult Treatment Panel III)// JAMA.+ 2001. – v.285. – p.2486–97.

7. Friedewald W., Levy R., Fredrickson D. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without use of the preparative ultracentrifuge// Clin Chem. –

1972. – v.18. – p.499–502.

8. Myers G., Kimberly M., Waymack P. et al// A reference method laboratory network for cholesterol: a model for standartization and improvement of clinical laboratory measurements// Clin Chem. – 2000. – v.46. – p.1762–1772.

9. National Cholesterol Education program.; expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholestrol in adults // Arch.Intern. Med. – 1988. – v. 148. – p.36–69.

10. National Cholesterol Education program. Second report of the Expert Panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholestrol in adults // Circulation. – 1994. – v. 89. –

p.1434–1503

11. Nauck M., Warnick G., Rifai N. Methods for measurements of LDL+cholesterol: a critical assessment of direct measurement by homogeneous assays versus calculations// Clin Chem. –

2002. – v.48. – p.236–254.

12. Rifai N., Cooper G., BrownW. et al. Clinical Chemistry journal has contributed to progress in lipid and lipoprotein testing for fifty years// Clin Chem. – 2004. – v.50. – p.1861–1870.

13. Study group, European Atherosclerosis Soсiety. Strategies for the prevention of coronary heart disease // Eur. Heart J. – 1987. – v.8. – p.77–88.