Эмбриональные и взрослые стволовые клетки: место в современной медицине

 Бурное развитие биоинформатики  в конце ХХ века  существенно повлияло  на стратегию развития биологии.  Журнал Science назвал открытие стволовых клеток главным событием биологии ХХ века, наряду с расшифровкой двойной спирали ДНК, генетического кода и реализацией программы «Геном Человека». Перечисленные события изменили менталитет биологии. Впервые были созданы экспериментальные мосты, соединившие мир каталитических молекул и мир мегабайтов (сигналов) в клетках. Ноберт Винер первый предложил  новую концепцию  живой клетки  как  информационного чипа. На входе потоки питательных веществ, энергии и информации преобразуются в секрецию, локомоцию, фагоцитоз и другие элементарные физиологические ответы.  Организованное поведение молекул внутри клеток преобразуется в организованное поведение клеточных органелл. 95% клеток взрослого организма представлено терминально дифференцированными соматическими линиями: кардиомиоцитами, гепатоцитами, энтероцитами, нейронами, эндокринными и иммунными клетками и т.д.  Все соматические клетки стереотипно функционируют в режиме автоматов: отвечают стандартным поведением на стимулы. Регуляторная информация по минимуму используется для поддержания химического и функционального гомеостаза. В отличие от соматических дифференцированных клеток,  стволовые клетки эмбриона и взрослого организма являются soft-makers, серийными множителями программ развития. Стволовые клетки экспрессируют новые гены развития, сигнальных сетей и рецепторных межклеточных взаимодействий, управляющих размножением, миграцией, дифференцировкой клеток, сборкой тканей и органов. Образно говоря, стволовые клетки создают новые поколения обученных клеток для согласованного взаимодействия и выживания в организме. Конечный продукт стволовых клеток  не может быть измерен средствами морфологии или физиологии, поскольку представляет собой потенциальную информацию для новых сетей молекулярных и клеточных взаимодействий в будущих клетках. В стволовых клетках содержится минимальное количество молекулярных машин и механизмов для клеточной физиологии. Главная «начинка» стволовых клеток – это регуляторные «софты» и программы на будущее. Однако сами стволовые клетки как первоисточники программ эмбриогенеза  действуют в кооперации с двумя другими силами развития: а) эмбриональной индукцией  б) постоянной обратимой эпителио-мезенхимальной трансформацией клеток зародышевых листков. На каждом новом этапе развития эмбриональная индукция – информационный диалог двух-трех  провизорных тканей зародыша является непременным триггером развития. Одновременно сигналы микроокружения диктуют адекватный морфологический статус клеткам. Мезенхимальное ядро (строма) будущих органов  отвечает за реализацию 3-D- карт будущих органов. Эпителиальная граница органов отвечает за  барьеры, компартментализацию, паттернинг  (имагинальные диски, сомиты, ромбомеры и другие периодические провизорные структуры) [1].

Локальные сигналы микроокружения в пределах стволовой ниши предопределяют варианты поведения стволовых клеток. Подавляющая часть стволовых клетках в естественных нишах  находятся в стабильно неактивном состоянии (дормантный статус) неактивных постмитотических клеток  (quiescense), пролиферации в статусе плюрипотентных клеток, миграции и дифференцировки клеток вне стволовых ниш.   Существенно, что  в нормальных  нишах  работает механизм, защищающий стволовые клетки от канцерогенеза. В условиях культуры  на фидере эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) находятся в режиме быстрого размножения ЭСК клонов – чистый инфо-катализ – серийное копирование  софт-программ развития  без их реализации [18].

Во взрослом организме лишь часть  стволовых клеток находится в активном состоянии. Подавляющая часть ЭСК, локализованных в паренхиме органа,  а также мезенхимальных стволовых клеток, локализованных в строме органов, находятся в стабильно неактивном состоянии. Остается неизвестным, почему  острые или хронические повреждения органов не вызывают активации «запасников» стволовых клеток взрослого организма.  Поведение и судьба  стволовых клеток на территории ниши определяется набором генов плюрипотентности в виде мРНК и предсинтезированных белков, набором транскрипционных факторов, репрограммирующих структуру хроматина, а также набором активирующих/ингибирующих эпигеномных  сигналов на территории стволового пространства, продуцируемые клетками микроокружения. Таким образом, поведение стволовых клеток in situ предопределяется  сложным сигнальным взаимодействием всех клеток  стволовой ниши. Плюрипотентность, дормантность и другие паттерны поведения являются свойством клеточной территории, а не качеством изолированных ЭСК.  Потому в культуре чаще всего воспроизводится статус самообновления клеток на фидере, но плохо моделируется дормантность и другие функциональные статусы ЭСК. Первые ЭСК появляются в  зародыше на стадии эпибласта – монослоя из 650 эпителиальных клеток. Неизвестными пока кодами  территория эпибласта с помощью  специальных клеток (founder cells)  превращается в карту будущих органов. В каждой такой клетке эпибласта начинают работать 3-D-коды,трансформирующие  трехмерные градиенты  морфогенов  в трехмерную сборку клеток.

Изолированные в культуру ЭСК из эпибласта лишь частично сохраняют способность к организованной сборке клеток в орган. Более существенно, что  наработанные неорганизованные массы ЭСК способны к направленной дифференцировке в любую из 250  соматических линий клеток взрослого организма. ЭСК открыли путь к лабораторному получению главных клеток паренхимы и мезенхимы органов в обход   оплодотворения, гаструлы и органогенеза.

Установлено, что эмбриональные стволовые клетки  сохраняют идентичность (генетическую плюрипотентность)  в статусе эпителия (Е-кадхерин, цитокератин позитивных клеток), в статусе примитивных ошаренных клеток в суспензионном клоне, а также в статусе одиночных мигрирующих клеток мезенхимы (виментин+ кадхерин+ ГМК-альфа-актин-позитивных клеток). В ходе гаструляции  подавляющая часть экстраэмбриональной  и эмбриональной мезодермы и эндодермы продолжает развитие в статусе мезенхимы, тогда как головная часть эпибласта трансформируется в нейроэктодерму, сохраняя статус эпителия. Далее значительная часть мезодермы реэпителизуется  в сомиты. Под влиянием сигналов нотохорды  склеротомная часть сомитов подвергается новому раунду эпителио-мезенхимальной трансформации. В ходе формирования и роста печени, поджелудочной железы провизорные клетки подвергаются  5-7-кратным циклам обратимой смены морфологического статуса эпителий-мезенхима-эпителий. Таким путем достигается быстрый рост органов зародыша за счет собственного общего пула клеток. Во вторых, достигается  координированный согласованный рост и дифференцировка паренхимы и мезенхимы органов. Следовательно, морфотип стволовых клеток в зародыше не является однозначным маркировщиком специальных функций стволовых клеток как серийных программистов (soft-makers).

 

Главные трудности изучения  и моделирования  постгаструлы, примитивной полоски, экстраэмбриональных провизорных тканей связаны  с  артефактами эмбриональной индукции, которые возникают в эмбриоидных тельцах на стадии их постмитотической дифференцировки in vitro. В многочисленных исследованиях на ЭСК человека и животных установлено, что спонтанная дифференцировка кардиомиоцитов, нейронов, остеохондролиний, эндотелиальных или гематогенных линий  блокирует в первую очередь пролиферацию прогениторов, ответственных за формирование экстраэмбриональной провизорной ткани (ЭЭ-мезодермы, ЭЭ-эндодермы). Как известно, клетки нотохорды, узелка, гипобласта,  экстраэмбриональной эндодермы и мезодермы незаменимы для формирования главных осей и закладки 3D- карты зародыша  путем эмбриональной индукции. По этой причине в дифференцированных  агрегатах ЭСК не только блокировано организованное развитие эмбриональных/провизорных тканей, но и осевое развитие (включая подключение Нох-генов и гены паттернинга). Экспрессия всех генов, контролирующих осевой органогенез, находится в культуре ЭСК на минимальном уровне.

На данном этапе, интерес специалистов сосредоточен на разработке софт-программ наработки значительных количеств высокоочищенной мезодермы, эндодермы, нейроэктодермы в виде неорганизованной массы клеток (сырья). В этом разделе будут описаны некоторые важные прорывы в этой узкой области.

 

 

Название гена                                                                             Результат нокаут-делеции   Brachyury -/-                                                                   Блок гаструляции и образования мезодермы Goosecoid -/-                                                                  Полный блок  примитивной  полоски FGFR1-/-                                                                        блок формирования эндодермы Laminin -/-                                                                     блок экстра-эмбриональной эндодермы Двойная доза Rac-1, CDC-42                                        блок эпителио-мезенхимальной трансформации                                                                                       эпибласта, нет гаструлы Rho A -/-                                                                        перепродукция мезодермы в зародыше E-cadherin /-                                                                  аномалии эпибласта и гаструлы FGF-4 -/- FGF-8 -/-                                                                        летальные аномалии гаструляции   TFG-B -/-                                                                        летальные аномалии гаструлы без мезодермы BMP-4 -/- Nodal -/-                                                                        летальные аномалии гаструлы без мезодермы Smad -4 -/-                                       GATA-4 -/- HNF -1 -/-                                                                      тотальное отсутствие эндодермы Casanova -/-                                    Mixl1 -/-                                                                        летальные аномалии аксиальной мезодермы, нет                                                                                       передней и задней кишки Sox 17-/-                                            уменьшена доля дефинитивной эндодермы, компенсаторно                                                                                                                     увеличена доля  висцеральной эндодермы Nodal -/- Oct3 -/-                                                                         отсутствует нейральная пластинка  и  нейроэктодерма FGF-5 -/-   Frz -/-                                                                           нет примитивной пластинки, node, нет мигрирующей Wnt-11 -/-                                                                     мезодермы Wnt3a -/-    Pbx6 -/-                                                                       блок развития параксиальной мезодермы, гипертрофия                                                                                     нервной трубки Lef-/- Tcf -/-                                                                 блок параксиальной мезодермы, гипертрофия  нервной                                                                                    трубки Wnt3a -/-                                                                      блок параксиальной мезодермы, гипертрофия нервной                                                                                     трубки Wnt5a  -/- Cyp26 -/-                                                                     арборизация  позвоночника и аномалии осевого развития Raldh 2-/-   Desmin  -/-                                                                    полный блок  миогенеза   SHH-/-                                                                        системный дефицит сосудистого эндотелия                                                                                  Ограниченное образование эндотелиальных прогени-                                                                                  торов из МСК   Otx2 -/-                                                                     нет аксиальной мезодермы и  переднего  мозга

 

 

В ходе гаструляции и формирования мезо-, эндо- и эктодермы происходит необратимая утеря экспрессии канонических генов, контролирующих плюрипотентность генома истинных ЭСК : Oct4, Nanog, FoxD3, Rex-1. Перечисленные белки, контролирующие плюрипотентность истинных стволовых клеток, характеризуются наличием более 20 доменов связывания.  Плюрипотентность – это специальный статус  почти полностью репрессированного генома клеток. Белки, контролирующие плюрипотентность,  формируют сеть, которая  упаковывает в неактивные комплексы все петли эухроматина хромосом стволовых клеток. Активация первого эшелона генов мезодермы (Brachyury, goosecoid, desmin, flk1. PDGFRA), эндодермы (СXC4R, Sox17, FoxA2, N-cadherin, Nodal –receptor) и нейроэктодермы (nestin, Sox-1, Sox-2, FGF-5)  автоматически сопровождалась выключением экспрессии всех  генов, контролирующих плюрипотентность. По этой причине никому до сих пор не удавалось выделить культуру плюрипотентных ЭСК из зародышей млекопитающих после гаструлы (например из зародышевых листков). Репрограммировать до статуса полноценных ЭСК in vitro удалось лишь клетки примитивной  нейроэктодермы, но не клетки мезодермы или эндодермы. Для получения эпибласта  in vitro  клетки примитивной нейроэктодермы выращивали на базальной мембране из ламинина, на которой формировался пласт плотно упакованных поляризованных эпителиальных клеток. Показательно, что ламинин не имеет никакого сродства к клеткам примитивной эндодермы.

Второе обстоятельство, влияющее на успех репрограммирования  клеток зародышевых листков, это антагонизм программ развития зародышевых листков. Например, главные индукторы гаструляции и мезодермы Nodal, Cripto, TGFB являются сильнейшими блокаторами образования нейроэктодермы. Комплекс Nodal-Cripto –главный триггер гаструляции - является мощным блокатором нейрогенеза. Экспрессия Brachyury Goosecoid исключает экспрессию генов нейроэктодермы (FGF-5, Pax-6, Rex-1, Sox-1, Zpf42, Nkx 2.2 and Neuro D [14].

Полное выключение гена Cripto  у мышей (Сripto-/-)  вызывает остановку кардиогенеза и компенсаторное избыточное развитие нервной ткани. Лишняя доза гена  FoxA2   вызывает избыточное развитие эндодермы за счет мезодермы. Выключение гена-регулятора эктодермы  EED вело к перепродукции мезодермы за счет эктодермы  зародыша. Наконец, аппликация нейроиндуктора Noggin к тканям зародыша приводила к замедлению роста и развития мезодермы и эктодермы. Изучение функций  ранних генов-регуляторов начального развития с помощью техники knock-out (двойной гомоделеции гена) или  knock-down (селективного подавления экспрессии с помощью мРНК-антагониста)  на уровне стволовых клеток позволило выяснить множественные функции генов в гаструле, примитивной полоске и зародышевых листках (Таблица 1). Не менее плодотворным оказалось изучение образования зародышевых листков из ЭСК  в культуре.

 

Высокая концентрация сыворотки  в культуре агрегатов ЭСК является наиболее мощным индуктором   Brаchyury+ Flk1+ PDGFRA+  мезодермальных клеток. Фактор транскрипции Srf (serum response factor)  является ключевым регулятором образования мезодермы. В мутантных ЭСК Srf-/- полностью блокировано образование мезодермальных  Brachyury+ клеток. Предполагают, что  Srf   в комплексе с Rho-A-ГТФ-азой перестраивает цитоскелет, позволяя клеткам  мигрировать в разных направлениях,  синтезировать 3-D-матрикс и экспрессировать гены мезодермы. Добавление 1% ДМСО  вызывало образование 5-8% мезодермальных клеток в культуре ЭСК. Ретиноевая кислота, индуцируя нейрогенез, полностью блокировала образование мезодермальных клеток в культуре ЭСК. В среде без сыворотки комбинации ВМР-4, TGFB и Nodal  индуцировали максимальную дифференцировку мезодермы  (25 -40% клеток). Одновременно TGFB и Nodal полностью блокировали развитие нейроэктодермы и эктодермы в агрегатах ЭСК. Наоборот, в  мутантных ЭСК  Nodal-/- TGFB-/-  наблюдали усиленный нейрогенез за счет полного дефицита мезодермы и эктодермы.  ВМР-2 селективно  индуцировал образование  экстраэмбриональной эндодермы и блокировал развитие нейроэктодермы [2,3,37].

В среде без сыворотки ВМР-4 быстро стимулировал появление Brachyury+Flk1+ мезодермы,  блокируя появление клеток эндодермы и эктодермы [34]. TGFB лишь краткосрочно стимулировал накопление мезодермальных клеток, поскольку в дальнейшем блокировал их пролиферацию. В последнее время научились получать раздельно  латеральную и параксиальную мезодерму в культуре ЭСК. С помощью поточной цитофлуориметрии удалось отсортировать из общего пуля примитивной мезодермы (Brachyury+ Flk1+ PDGFRA+  клеток)   клетки латеральной мезодермы (Flk1+ N-cadherin+ популяции), которые в дальнейшем дифференцировались в Flt4+ GATA-2+ Tal1+ Iкaros+ VECD+ клетки – второй эшелон прогениторов. На третьем этапе они дифференцировались в эндотелий, перициты и гематопоэтические клоны. Вторая отобранная популяция  параксиальной мезодермы отличалась фенотипом PDGFRA+ Flk1-. На втором этапе они генерировали прогениторы с фенотипом Tbx6+ Mesp2 +  Dil1+  Follistatin+ FGF8 + , которые терминально дифференцировались в хондроциты, остеоциты  и другие линии соединительной ткани [5].

Важно подчеркнуть, что основная часть мезодермы  в культуре агрегатов ЭСК образуется не из эпибласта, а разрозненных  ЭСК в статусе эпителия (Е-кадхерин+ клетки).   Образование мини-фрагментов примитивной полоски удалось наблюдать в культуре эмбриоидных агрегатов ЭСК обезьян-мармосетов [5]. Первое поколение  мезодермальных клеток, формирующих экстраэмбриональную мезодерму, дифференцируется в гемато/эндотелиальные клетки желточного мешка в результате прямого сигнального взаимодействия с пластом экстраэмбриональной эндодермы.  Клетки примитивной полоски (в статусе мезенхимы) формируют гематогенные клоны и эндотелий под влиянием IHH+ bFGF [9,11].

 

 

 

 

В дифференцирующихся крупных агрегатах ЭСК образование примитивной эндодермы прежде всего происходило во внешнем слое сфер. ВМР-4 в комбинации с сывороткой наиболее активно стимулировал образование эндодермы, в которых избирательно и опережающее выключалась экспрессия гена плюрипотентности  Nanog.  Долю эндодермы в ЭСК  увеличивали, добавляя в среду bFGF /HGF [35].  В культуре  ЭСК человека эмпирически удалось нащупать  этап трансформации Е-кадхерин+  клеток в N- кадхерин-позитивные (мезенхимальные) клетки в бессывороточной среде в присутствии 100 нг/мл  активина А за 24 часа в культуре. В следующие 24 часа у новообразованных N-кадхерин + клеток индуцировали экспрессию  рецептора примитивной эндодермы CXRX4  добавлением активина А в присутствии 0,2% фетальной сыворотки. Далее повышение концентрации сыоротки до 2% в присутствии активина А вызвало экспрессию ранних генов эндодермы - Sox17 и FoxA2 [10]. За 3 суток градуальной активации

 ЭСК удалось довести содержание клеток дефинитивной эндодермы до 80%. Этим новым путем удалось получить высокоочищенную эндодерму через эффективно контролируемую стадию трансформации Е-кадхерин+ ЭСК в N- кадхерин+  МСК. Эспрессия FoxA2  в N-кадхерин примитивной эндодерме автоматически запускала реэпителизацию мезенхимы в эпителий.

 Эмбриональная индукция в культуре  ЭСК

Образование примитивной полоски, гаструляция и органогенез через провизорные ткани эндо-, мезо- и эктодермы  реализуются с помощью двух  действующих сил: эмбриональной индукции и обратимых эпителио-мезенхимальных переходов . Мишенью действия этих начальных сил эмбриогенеза являются не изолированные стволовые плюрипотентные клетки, а примитивные первичные ткани зародыша. Однако феномены и механизмы эмбриональной индукции оказалось возможным наблюдать и расшифровывать в культуре ЭСК. 

Весьма характерно моделируются кардиогенные эффекты бислоя прекардиогеннной мезодермы/эндодермы в культуре ЭСК.  Если доля образования кардиомицитов на простом фидере из фибробластов была в пределах 7-16 %, то эксплантат кардиогенной мезодермы/эндодермы вызывал 100 % образование ритмически сокращающихся кардиомиоцитов [33]. Другие авторы сообщили лишь о 35% кардиогенном эффекте при совместном культивирования ЭСК человека с линией эндодермы  END-2 [27]. Предполагают, что главным индуктором кардиомиоцитов является сигнал-индуктор Sparc, выделяемый клетками кардиогенной эндодермы в статусе мезенхимы. Sparc индуцирует экспрессию GATA-4, GATA-6, Nkx 2.5, Mef2C в кардиогенной мезодерме. Ингибиторы Sparc/BMP-2  тормозили кардиогенез из ЭСК [36].  С помощью агонистов кардиогенной дифференцировки ДМСО (стимулирующего экспрессию гена Сripto), либо  ВМР-4 / TGFB удавалось достичь кардиогенной дифференцировки лишь у 10-15% ЭСК.  Производственная  наработка  больших количеств  кардиомиоцитов для целей терапевтической трансплантации выглядит более предпочтительной с фидером-индуктором, поскольку в бессывороточных средах кардиомиоциты практически не выживают.

В случае спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в среде с высокой концентрации сыворотки доля возникающих эндотелиоцитов не превыщала 1-3%. Технологию получения эндотелия удалось существенно улучшить, когда  стали работать с GFP-ЭСК, мечеными по промотеру Brachyury. Новые дифференцированные клетки мезодермы переставали светиться из-за выключения гена Brachyury. Несветящиеся клетки прицельно исследовали на маркеры эндотелия. Порядок включения генов ангиогенеза повторял эмбриогенез: Flk1- Flt4- Ang1-Ang2-VE-cadherin  CD34 vWF [13,15].

Оказалось, что клетки эмбриобласта и эмбриоидных телец не дифференцируются в эпибласт без экстра-эмбриональной эндодермы. Образование типичных мезодермальных Brachyury+ Goosecoid+ Flk1+ PDGFRA+ мезодермальных клеток наблюдали из эпибласта при добавлении в культуру экстра-эмбриональной эндодермы.  Добавление дефинитивной эндодермы, эктодермы, мезодермы не индуцировало образование мезодермы из клеток эпибласта [7]. Первые кластеры мигрирующих  мезодермальных клеток формируют первые островки эндотелия на границе зародыша и желточного мешка [12]. В самом зародыше млекопитающих удаление гипобласта (передней висцеральной эндодермы) провоцировало преждевременное формирование примитивной полоски. У мутантных зародышей Cerebrus-/- Nodal -/- (главных блокаторов гаструляции, локализованных в гипобласте) наблюдали  множество копий первичной полоски [29].  Первые мезодермальные клетки зародышей млекопитающих уходят на формирование  передней висцеральной эндодермы. Висцеральная передняя эндодерма с помощью  негативных сигналов (Hex, Dkk1, Lefty-1, Cer-1)  нейтрализовала действие TGFB/Wnt3a –сигнальных  каскадов на территории будущей нейроэктодермы. Остается неизвестным, почему уровень экспрессии генов, контролирующих осeвое развитиe зародыша, резко снижается  в культуре ЭСК, что является одной из причин  утраты  организованного роста тканей в эмбриоидных тельцах [6].

Индукция со стороны висцеральной передней эндодермы необходима для дифференцировки эпибласта в первичную эктодерму. Главным нейро-индуктивным сигналом оказался IHH, секретируемый висцеральной эндодермой.  Мутантные линии ЭСК IHH-/- оказались  неспособными к нейрогенезу, индуцируемому ретиноевой кислотой [25].  Было показано, что среда инкубации клеток линии гепатомы Hep-G2  также способна репрограммировать клетки эпибласта в клетки первичной нейроэктодермы. Эктодермальные примитивные клетки сохраняют экспрессию генов плюрипотентности (Oct4, Nanog, uvomorulin- простейший кадхерин), одновременно экспрессируя  FGF5, Rex-1, Gbx1, Sox1 – маркеры примитивной нейроэктодермы [31].

В начале 80-х ХХ века  А.Я. Фриденштейн описал способ выделения и идентификации мезенхимальных клоногенных стволовых клеток из взрослого костного мозга. В малых плотностях посева  в среде с высокой концентрацией сыворотки часть фибробластоподобных клеток после прикрепления формировали колонии, которые дифференцировались в  остеобласты, хондроциты или адипоциты. Позднее сходным образом мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были выделены из стромы многих взрослых органов млекопитающих и человека.  Первоисточник этих клеток  в зародыше оставался неизвестным. Идентификация первичной зародышевой мезенхимы осложнялась тем обстоятельством, что подавляющее число мигрирующих клеток мезодермы и эндодермы имели фенотип мезенхимальных клеток. В ходе гаструляции средняя и задняя часть эпибласта подвергается эпителио-мезенхимальной трансформации в  первичную полоску, мезо- и эндодерму. Однако  возникающая из эпибласта (или ЭСК) мезодерма  отличается набором маркером от классических  МСК, описанных Фриденштейном (Таб 2)

 

Многие соображения заставляли предполагать, что формирование первичной эмбриональной мезенхимы должно быть связано с очагами гемоангиопоэза. Изучение примитивного кровeтворения в желточном мешке показало, что образование эндотелиальных клеток, капилляров, гематогенных клонов происходило на стыке слоев экстраэмбриональной мезодермы и висцеральной эндодермы  через  Brachyury+ Goosecoid+ PDGFRA+ Flk1+  мезодермальные дериваты без сопутствующего появления МСК. Согласно наиболее распространенному мнению, образование  гемангиобластов, эндотелиальных клеток и  гематогенных стволовых клеток происходит в три этапа :1) ранние промежуточные коротко живущие прогениторы мезодермы с фенотипом Brachyury+  Flk1+ Scl1 +  2) эта первичная популяция генерирует более устойчивую и долго живущую популяцию гемангиобластов с фенотипом:  Flk1+ Scl1+ Brachyury-  3) общий пул гемангиобластов дифференцируется в двух направлениях -  гематогенные прогениторы (Scl1+ Flk1- GATA-2+) и эндотелиальные линии (Flk1+ GATA-2 -  Scl1 -).

Никаких  других линий стромальных клеток с фенотипом  МСК в культуре ЭСК не возникало.  Все попытки обнаружить клоногенные культуры МСК в желточном мешке дали отрицательные результаты  [26]. Таким образом, первичное кроветворение и васкулогенез в желточном мешке происходили без участия мезенхимальных стволовых клеток.

Первые  клонообразующие  МСК с дифференцировкой в остеогенные, хондрогенные и адипогенные линии  были идентифицированы  в аорто-гонадном зачатке, где преобладали скопления примитивных Flk1+ PDGFRA+  мезодермальных прогениторов. По-видимому, появление «канонических»  МСК  в аорто-гонадном  зачатке  не было связано с появлением более зрелых дефинитивных гематогенных клонов. У зародышей мышей  Runx1-/-  выключение гена, контролирующего появление зрелых дефинитивных гематогенных клонов в аорте не изменяло численность новообразованных МСК. Runx1 ген в дорзальной аорте зародыша контролирует появление первичных гематогенных кластеров [23]. В 11-дневных зародышах мыши появляются первые МСК в циркулирующей крови. Первичные сигналы, вызывающие появление первых МСК в аорте 11-дневных зародышей мышей, остаются не расшифрованными. Показано, что относительная численность МСК  в фетальной печени на общую численность клеток возрастает. В постнатальном костном мозге  процент содержания  МСК в костном мозге существенно снижается.

В постнатальном периоде физиологическое обновление сосудистого эндотелия как и ускоренная форсированная репарация эндотелиальной выстилки происходит с помощью разных пулов эндотелиальных прогениторов, мобилизуемых в кровоток из костного мозга, скелетных мышц и жировой ткани.  Подавляющая часть  циркулирующих эндотелиальных прогениторов маркируется  Flk-1, flt-4, CD133, CD105 (эндоглином) и VE-кадхерином. Эта часть прогениторов вызревает из МСК стромы органов. Меньшая часть эндотелиальных прогениторов маркируется Flk-1, flt-4,  CD133 low CD44 low, что косвенно указывает на их мезодермальное происхождение.

До последнего времени  не было описано технологий прямого лабораторного получения мезенхимальных стволовых клеток из ЭСК. В смешанных плотных культурах дифференцированных эмбриоидных телец наблюдали кавитацию в части агрегатов ЭСК. В этой части материала наблюдали образование фрагментов зародышевого цилиндра, эпибласта, примитивной ЭЭ-эндодермы и клеток примитивной полоски (возникающих эпителио-мезенхимальной трансформацией из Е-кадхерин+клеток эпибласта [5]. Массовое лабораторное получение МСК из ЭСК человека удалось воспроизвести в смешанной культуре, когда ЭСК человека линии Н9 и Н1 сокультивировали с монослоем стромальных клеток линии ОР-9 в присутствии МЕМ и 10% сыворотки. Репрограммирование клеток происходило на фидере из  пула добавленных ЭС клеток. Новообразованные МСК изолировали с помощью клеточного сортировщика клеток, отбиравшего СВ73+  Stro-1+ VCAM+  CD105+  ГМК-альфа актин+  и виментин+ клетки [4]. В работе указывается, что все новообразованные популяции возникли из параксиальной мезодермы.  Однако   верификация возникновения параксиальной мезодермы с помощью Brachyury, Goosecoid,  Flk-1,  PDGFRA маркеров не приведена.

В настоящее время описано несколько довольно простых путей дифференцировки МСК в эндотелиальные клетки в культуре. Инкубация монослоя МСК с 50 нг/мл VEGF2 -2% FCS-LG-DMEM  вызывает полную реэпителизацию монослоя за 1 неделю.  Кокультивирование преконфлуентной культуры МСК с монослоем сосудистого эндотелия вызывает дифференцировку МСК в типичный пласт эндотелиальных клеток. Инкубация МСК с главными проангиогенными сигналами (SHH+ VEGF)  вызывает форсированную дифференцировку стромальных клеток в эндотелий с экспрессией  Flk1 ,VE-cadherin, Ang1, Ang2, Tie1, Tie2 генов. Напомним, что резервная библиотека мРНК МСК содержит мРНК практически всех генов  ангиогенной дифференцировки.

 

Плюрипотентные мезенхимальные стволовые клетки взрослых тканей

За последние годы интерес к изучению гетерогенных МСК, наделенных высокой пластичностью к адаптивной дифференцировке и репрограммированию, нарастал из-за более очевидных возможностей их практического применения. Любые проекты с ЭСК в клинике сопряжены с комплексом трудно решаемых технических, моральных, социальных последствий в области репродуктивного и терапевтического клонирования. Даже  крупные корпорации  сейчас буксуют на уровне получения патентов на новые клеточные технологии, а особенно на способы лечения, лицензирование которых не поощряется.  Главные проблемы в идентификации  линий МСК в культуре связаны с принципом «неопределенности», начинающим работать в популяции изолированных МСК. Их генетическая «избыточность», обсловленная гигантским «портфелем» предсинтезированных мРНК и мощной протеомикой сигнальных сетей/транскрипционных факторов, является причиной широкого варьирования фенотипа и поведения под контролем сигналов микроокружения [30].  У МСК есть резервы  в up-stream репрограммировании генома: часть клеток, пересаженных в бластоцисту, встраивались в зародышевые листки и давали клеточные линии – производные экто-, мезо- и эндодермы [20]. Большинство недифференцированных МСК в культуре не имеют Oct4, Rex-1, Nanog.  Однако до 30% клеток содержат СD133 (белок плюрипотентности, наделенный способностью находиться в ядре в комплексе с тумор-супрессором р53) [21]. МСК с экспрессированным CD133  активнее ре-эпителизуются  in vitro. Важная особенность МСК постнатального (особенно из взрослого костного мозга) – это потеря  способности генерировать зародышевые листки и экстра-эмбриональные провизорные линии клеток. По этой причине, большинство лабораторных путей дифференцировки МСК в кардиомиоциты, эндотелий, остеобласты, гепатоциты, эндокринные клетки поджелудочной железы  работают по «укороченной» программе, минуя промежуточные стадии эмбриональной индукции между зародышевыми листками и экстраэмбриональными тканями.  Важным маркером «молодых» линий МСК постнатальных и взрослых тканей – отсутствие потенциала дифференцироваться в типичные  клоны фибробластов, синтезирующих избыток коллагена I типа.  Только часть клонов или часть потомства изолированных МСК дифференцируются в  остеобласты, которые быстро минерализуются. МСК могут также дифференцироваться в определенных условиях в миофибробласты и гладкомышечные васкулярные клетки, имеющие отличный от фибробластов фенотип. Более того, аппликации МСК в зону повреждения кожных покровов, приостанавливают развитие рубцовой ткани. Однако с возрастом « стареющие» МСК приобретают способность к конверсии в фибробласты и  рубцеобразованию в ходе регенерации. Молекулярно-клеточная диагностика «старения» МСК в организме  существенна для  своевременной  диагностики многих  возрастных заболеваний человека (атеросклероз, кардиосклероз, интерстициальные легочные фиброзы, цирроз печени и почек и т.д.)

Сценарий поведения МСК в культуре далек от поведения соматических клеток-автоматов. Пассируемые в пределах одного клона, линии МСК в пассажах расширяют и увеличивают диапазон молекулярного разнообразия и soft- программ [28].  Потенциал дифференцировки изолированных линий МСК всегда выше возможностей конверсии в главные линии зрелой соединительной ткани. Благодаря автоматике мезенхимо-эпителиальных превращений значительная часть МСК способна подвергаться контролируемой эпителизации под влиянием соответствующих индукторов.

Созданы модели животных с хроническими повреждениями органов, где системная инфузия МСК в кровоток вызывает избирательное четко регистрируемое вовлечение донорских клеток в репарацию эпителиальных модулей (нефронов, альвеол, ацинусов).

[16,19,39].

 

Существуют экспериментально и клинически обоснованная концепция атеросклероза, связывающая  начальные фазы поражения артериальной стенки с ускоренным старением эндотелиальной выстилки. Эндотелий крупных магистральных артерий не имеет собственных запасов стволовых клеток. Обновление  выстилки происходит за счет МСК костного мозга, поступающих в кровоток в виде прогениторов эндотелия. Первые доклинические стадии заболевания (до ишемической болезни сердца)  диагностируются по дефициту эндотелиальных прогениторов  в кровотоке [1,32]. Описаны возрастные дефекты  репарации роговицы из-за исчезновения стволовых клеток эпителия в лимбе.  Пигментозный ретинит и макулярная дегенерация также являются  ярким примером возрастного дефицита стволовых клеток в сетчатке [38]. Возрастной (в том числе постменопаузальный остеопороз) представляет собой весьма распространенный вариант ускоренного старения костной системы за счет дефицита остеопрогениторных клеток (в том числе за счет дефицита их поступления в кровоток из костного мозга). Дефекты  системного и регионарного остеогенеза   верифицируются измерением уровня ключевых белков остеогенеза в крови. Важные подсказки на будущее дают исследования нокаут-мутаций, вызывающих полное истощение пула региональных стволовых клеток у экспериментальных животных. Например, недавно описана двойная делеция коротко-цепочечной ГТФ-азы Rac1, которая вызвала  полное исчезновение  региональных стволовых клеток и ускоренное старение эпидермиса кожи у животных [8].  Двойной дефицит гена плюрипотентности FoxD3-/-  вызывает полное исчезновение ЭСК в эпибласте [17].  Выключение фактора транскрипции FOXO3a  в фибробластах кожи вызывает ускоренное старение кожи, индуцирует остановку митозов [22]. У мышей без ядерной мишени  Wnt-сигнального каскада – TCF4 -/- происходит полная утеря стволовых клеток в криптах тонкой кишки [24]. Современная медицина нуждается  в новых фундаментальных разработках на уровне  knock-out –мутаций у животных, связывающих феномены ускоренного старения  с региональным или системным дефицитом стволовых клеток в организме.

 

 

 1. Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А., Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальных исследований в клинику, РеМеТекс,  Москва, 2002

2. Bachiller D., Klingensmith J., Kemp C. et al., The organized factor chordin and noggin are required for mouse forebrain development, Nature, 2000, 403, 658 – 61

3. Balemans W., Van H.W., Extracellular  regulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktail of modulators, Dev. Biol., 2002, 250, 231 – 50

4. Barberi T., Willis L.M., Socci N.D. et al., Derivation of multipotent MSC from hESC, PloS Medicine, 2005, 2, E161- E170 (0554-64)

5. Behr R., Heneweer C., Viebahn C. et al., Epithelial-mesenchymal transitions in colonies of rhesus monkey ESC: a model for processes involved in gastrulation, Stem Cells, 2005, 23, 805 – 16

6. Beddington R., Robertson E., Axis development and early asymmetry in mammals, Cell, 1999, 96, 195 -210

7. Belaoussoff M., Farrington S.M., Baron M.H., Hemopoietic induction and re-specification of A-P identity by visceral endoderm signaling in the mouse embryo, Development, 1998, 125, 5009-18

8. Benitah  S., Frye M., Glogauer M. et al., Stem cell depletion through epidermal deletion of Rac1, Science, 2005, 309, 934 -39

9. Byrd N., Becker S., Maye P. et al.,   SHH is required for murine yolk sac vasculogenesis, Development, 2002, 129,  361-72

10. D’Amour K., Agulnick A.D., Eliazer S. et al., Efficient differentiation of  hESC to definitive endoderm, Nat. Biotechnol., 2005, 23, 1534-40

11. Dyer M.A., Farrington S.M., Mohn D. et al.,  IHH activates hematopoiesis and vasculogenesis and can respecify perspective neuroetodermal fate in the mouse embryo, 2001, 128,  1717-30

12. Eichmann A., Corbel C., Nataf  V. et al., Ligand-dependent development of the endothelial and hemopoietic lineages from embryonic mesodermal cells expressing vascular endothelial growth factor receptor 2, Proc. Natl. Acad. Sci. US, 1997, 94,  5141- 46

13. Ema M., Faloon P., Zhang W.J. et al., Combinatorial effects of flk1 and Tal1 on vascular and hematopoietic development in the mouse, Genes Dev., 2003,17, 380 – 93

14. Fehling H.J., Lacaud G., Kubo A. et al., Tracking mesoderm induction and its specialization to the hemangioblasts during ESC differentiation, Differentiation, 2003, 130, 4217 - 27

15. Feraud O., Prandini M.H., Vittet D., Vasculogenesis and angiogenesis from in vitro differentiation of moue ESC, Methods Enzym., 2003, 365, 214 – 28

16. Guo J.K., Schedl A., Krause D.S. et  al.,  Bone marrow transplantation can attenuate the progression of mesangial sclerosis, Stem Cells, 2006, 24, 406 – 15

17. Hanna L.A., Foreman R.K., Tarasenko I.A. et al., Requirement of FoxD3 in maintaining pluripotent cells of the early embryo,  Genes Dev., 16, 2650 - 61

18. Heng B.C., Liu H., Cao T. et al., Transplanted hESC as biological catalysts for tissue repair and regeneration, Med. Hypotheses, 2005, 64, 1085 – 88

19. Herrera M.B., Bussolati B., Bruno S. et al., Mesenchymal stem cells contribute to the renal repair of acute tubular epithelial injury, Int. J. Mol. Med., 2004, 14, 1035 - 41

20. Jiang Y., Jahagirdar R.I., Reinhardt R.E. et al., Pluripotency of MSC derived from adult marrow, Nature, 2002, 418, 41 -49

21. Kafienan W. , Mistry S., Williams C. et al., , Nucleostemin is a marker of proliferating stromal stem cells in adult human bone marrow, Stem Cells, 2005, in press

22. Kim H.K., Kim Y.K., Song I.H. et al.,  Down-regulation of FOXO3a accelerates cellular senescence in human dermal fibroblasts, J. Gerontol. Biol. Sci., 2005, 60A, 4-9

23. Lacaud G., Gore L., Kennedy M. et al., Runx1 is essential for hematopoietic commitment

24. Marshman E.,Booth C., Potten C.S., The intestinal epithelial cells, BioEssays, 2002, 24, 91 -98

25. Maye P., Becker S., Siemen H. et al., IHH signaling is required for the differentiation of ES cells into neuroectoderm, Dev. Biol., 2004, 265, 276 – 90

26. Mendes S.C.,  Robin C., Dzierzak E., Mesenchymal progenitor cells localize within hematopoietic sites throughout ontogeny, Development, 2005, 132, 1127 -36

27. Mummery C., Ward-VanOostwaard D., Doevendans P. et al., Differentiation of human ESC to cardiomyocytes: role of co-culture with visceral endoderm-like cells, Circulation, 2003, 107, 2733 - 40

28. Okamoto T., Aoyama T., Nakayama T. et al., Clonal heterogeneity in differentiation potential of immortalized hMSC, Biochem. Biophys.Res. Comms., 2002, 295,  354 - 61

31.

29. Perea-Gomez A., Vella F.D., Shawlot  W. et al., Nodal antagonists in the anterior visceral endoderm prevent the formation of multiple primitive streaks, Dev. Cells, 2002, 3, 745 – 56

21

30. Phinney D.G., Hill K., Michelson C. et al., Biological activities encoded by the mMSC transcriptome provide a basis for their developmental potential and broad therapeutic efficacy, Stem Cells, doi: 10.16.34/stemcells.2004-0236

31. Rathjen J., Lake J.A., Bettess M.D. et al., Formation of a primitive ectoderm like cell population, EPL cells, from ESC in response to biologically derived factors, J. Cell Sci., 1999, 112, 601 – 12

32. Rauscher F.M., Goldsmith-Clermont P,J., Davies B.H. et al., Aging,progenitor cell exhaustion and atherosclerosis, Circulation, 2003, 108, 457 - 63

33. Rudy-Rail  D., Lough J., Avian precardiac endoderm/mesoderm induces cardiac myocyte differentiation in mouse ESC, Circ. Res., 2004, 94, e107 – e114

34. Sakurai H., Era T., Jakt L.M. et al., In vitro modeling of paraxial and lateral mesoderm differentiation reveals early reversibility, Stem Cells, 2006, 24, 575 - 86

35. Schuldinger M.,Yanaka O., Itskovitz-Eldor D.A. et al., Effect of eight growth factors on the differentiation of cells derived from hESC, Proc. Natl. Acad. Sci., US, 2000, 97, 1307 -12

36. Stary M., Pasteiner W., Summer A. et al., Parietal endoderm secreted SPARC promotes early cardiomyogenesis in vitro, Exp. Cell Res. 2005,  in press

37. Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., Direct neural fate specification from ESC: a primitive mammalian NSC stage acquired through a default mechanism, Neuron, 2001, 30, 65 -78

38. The age-related eye disease study research group, Am. J. Ophtalmol., 2001, 132, 688 - 81

39. Yamamoto N., Terai S., Ohata S. et al., A subpopulation of bone marrow cells depleted by a novel antibody, anti-Liv8, is useful for cell therapy to repair damaged liver, Biochem. Biophys. Res. Comms., 2004, 313, 1110 - 18