Свойства и клинико-диагностическое значение определения эластазы из панкреатической железы и полиморфноядерных лейкоцитов.

  

 

Под названием «эластазы» объединена группа эндопептидаз, принадлежащих к сериновым протеиназам. В активном центре этих ферментов имеется классическая для сериновых протеиназ консервативная триада из остатков серина, гистидина и аспарагиновой кислоты, которые образуют ансамбль, осуществляющий нуклеофильную атаку на пептидные связи белков, и проводят  их гидролитическое расщепление. Эластазы проявляют специфичность к пептидным связям, образованным карбоксильными группами глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, а также других аминокислот, дающих гидрофобные остатки в полипептидных цепях.

В настоящее время известно, что эластазы присутствуют в различных органах и тканях и характеризуются общей энзиматической эластазолитической функцией.   Однако эластин не единственный белковый субстрат этих протеиназ. Они способны также гидролизировать коллагены III, VI и VIII генетических типов,  протеогликаны, гистоны, основной белок миелина, гемоглобин и множество белков плазмы крови, в том числе факторы гемокоагуляции, фибринолиза, калликреин-кининовой системы и комплемента.

Эластазы найдены в панкреатической железе, в азурофильных гранулах нейтрофильных лейкоцитов, тромбоцитах и макрофагах, в селезенке, стенке аорты, коже, почках. Обнаружены эластазы также в некоторых микроорганизмах и яде змей. Наиболее хорошо изученными являются эластазы из панкреатической железы, полиморфноядерных лейкоцитов  и макрофагов.

Все известные эластазы объединены общими указанными  выше энзиматическими свойствами, однако отдельные представители имеют целый ряд особенностей. Например, эластазы из макрофагов и некоторых микроорганизмов принадлежат, в отличие от других эластаз, являющихся сериновыми протеиназами, к цинк-содержащим металлопротеиназам. Они расщепляют пептидные связи остатков лейцина со стороны аминогруппы и гидролизуют, главным образом, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулины класса G и основной белок миелина. С меньшей скоростью эти эластазы, по сравнению с другими, гидролизуют эластин, так как в этом белке много остатков валина, аланина и глицина, но мало остатков лейцина. Кроме того, известные ингибиторы эластаз, в том числе α₁-протеиназный ингибитор (α₁-ПИ), не подавляет активность макрофагальной эластазы, но является наиболее эффективным плазменным ингибитором лейкоцитарной эластазы (ЛЭ). ЛЭ отличается высокой скоростью гидролиза широкого спектра белков и поэтому вовлекается в деструкцию различных тканей и участвует в развитии эмфиземы легких, артритов и других болезней воспалительного характера.

В последние годы в практику клинико-диагностических лабораторий активно внедряются методы определения эластаз из панкреатической железы (ПЭ1) и нейтрофильных лейкоцитов (ЛЭ). Эти ферменты различаются не только  органной принадлежностью, биологическими функциями, но и иммунологическими и некоторыми энзиматическими свойствами (Таблица 1).

 

Таблица 1.

 

 

Панкреатическая эластаза или эластаза 1 впервые описана в 1975 году Mallory и Travis как протеиназа Е. Через год этот фермент был охарактеризован как эстеролитическая панкреатическая протеиназа,  изучены его субстратная специфичность и ингибиторный спектр. Показано, что ПЭ принадлежит к семейству кислых сериновых протеиназ, синтезируется ацинарными клетками панкреатической железы и не обнаружена ни в каких других органах и тканях. Этот фермент продуцируется как зимоген, активируется трипсином с образованием ПЭ1, молекулярной массой 28 кДа. В клетках ПЭ1 содержится в виде проэластазы или в комплексе с панкреатическим ингибитором. Активация зимогена в норме протекает в двенадцатиперстной кишке. Фермент расщепляет белки по пептидным связям, образованным карбоксильными группами аланина, валина и лейцина и гидролизует, в основном, матричные белки, в том числе эластин и коллагены в ЖКТ. Активность ПЭ1 подавляется тканевыми серпинами (ингибиторами Кница и Баумана-Бирка) и серпинами плазмы крови (α₁-ПИ, α₂-макроглобулином).

В отличие от всех других ферментов поджелудочной железы,  содержащихся в панкреатическом и дуоденальном соке, ПЭ1 обладает высокой стабильностью при прохождении через кишечник и практически полностью резистентна к деградации другими протеиназами и микрофлоры ЖКТ. Было показано, что ПЭ обладает высокой стирол-связывающей способностью и движется по кишечнику в комплексе с желчными кислотами, что повышает ее устойчивость к гидролизу протеиназами.

Начиная с 1984 года эти свойства  ПЭ интенсивно изучаются. Детально охарактеризована ПЭ1 человека как эндопетидаза и стиро-связывающий белок, присутствующий в секрете и фекалиях. Количественная оценка фермента с помощью «ракетного» иммунофореза показала, что этот фермент действительно не разрушается при прохождении через ЖКТ и концентрация его в фекалиях в 5-6 раз выше, чем в панкреатическом соке. При физиологических условиях концентрация ПЭ1 в панкреатическом соке колеблется между 170 и 360 мкг/мл, что составляет, примерно, 6% от всех секретируемых панкреатической железой ферментов.

Высокая специфичность ПЭ1, устойчивость к протеолитическим ферментам и микрофлоре ЖКТ, к терапии препаратами ферментов ЖКТ, а также стабильность ПЭ1 при хранении  биологического материала (в течение 3-х дней при комнатной температуре и месяца при +4 С) послужило основанием для разработки тест-систем оценки концентрации иммунореактивной ПЭ1 в фекалиях, как показателя функции поджелудочной железы. К очевидным преимуществам иммунохимического определения  ПЭ1 в фекалиях следует отнести неинвазивность и высокую специфичность метода.

Проведено тщательное сравнение оценки иммунореактивной ПЭ1 в фекалиях с результатами прямого измерения секреции ферментов поджелудочной железы, отражающих ее функциональную активность. После стимуляции поджелудочной железы секретином и холецистокинином обнаружена прямая зависимость между содержанием ПЭ1 в панкреатическом соке и фекалиях и между секрецией ПЭ1 и секрецией амилазы, липазы, трипсина и бикарбонатов.

Известно, что инвазивные способы диагностики экзокринной функции поджелудочной железы, также как пакреозилин-секретиновый тест и его модификации, тест Lundh до сих пор остаются наиболее надежным стандартом выявления ее недостаточности благодаря высокой чувствительности и специфичности. Однако эти методы трудоемки, не стандартизированы, не комфортны для пациентов и требуют флуороскопических зондов. Поэтому в качестве альтернативных способов оценки функции поджелудочной железы  был введен ряд непрямых тестов, таких как определелие в фекалиях жира, химотрипсина, амилазы и липазы. Определение фекального жира используется стандартный тест для диагностики хронических панкреатитов и оценки жирового метаболизма, несмотря на малую чувствительность и неспецифичность. Более того, анализ фекального жира трудоемок и непопулярен  среди персонала лабораторий. Среди непрямых тестов функции поджелудочной железы широкое распространение получил метод определения химотрипсина в фекалиях, поскольку отличается весьма высокой диагностической чувствительностью (72-90%) и специфичностью (49-90%). Сравнительный анализ определения иммунореактивной ПЭ1 и перечисленных выше непрямых тестов оценки функции поджелудочной железы показал, что в отличие от ПЭ1, все другие непрямые тесты имеют ограниченную чувствительность при слабой и средней экзокринной недостаточности. Кроме того, они подвержены влиянию лекарств, рН среды, гастроэнтерологических операций, при этом резко снижается их специфичность и  особенно мало пригодны в клинической практике для диагностики начальных форм хронических панкреатитов. Так химотрипсин определяется у 85 % пациентов при хроническом панкреатите, при этом только у 49 % пациентов при слабой или ранней его манифестации. В фекалиях, в отличие от ПЭ1, определяется только 0,5 % химотрипсина от его активности в панкреатическом соке. На активность химотрипсина существенно влияют лекарства, содержащие ферменты поджелудочной железы. Наблюдают ложно-положительный ответ химотрипсина при непанкреатических заболеваниях:  циррозе печени, болезни Крона, гастроэктомии и других болезнях, связанных с диареей и мальадсорбцией. В отличие от химотрипсина, иммунореактивная липаза в фекалиях не чувствительна к заместительной терапии, но имеет низкую диагностическую чувствительность (34 %) при высокой специфичности (98 %).

В настоящее время имеются многочисленные доказательства того,  что определение  иммунореактивной ПЭ1 имеет наиболее высокую диагностическую чувствительность и специфичность при выявлении начальных форм хронических панкреатитов. При непанкреатических заболеваниях уровень ПЭ1 остается в норме (175 мкг/мг) и отличается низкой индивидуальной вариабельностью. Определение ПЭ1 имеет диагностическую чувствительность 63 % при мягких начальных формах панкреатита, 100 %  - при средних, 100 % - при тяжелых формах недостаточности поджелудочной железы. В целом для всех пациентов диагностическая чувствительность составляет 93%.

Таким образом, определение иммунореактивной  ПЭ1 в фекалиях имеет ряд несомненных преимуществ перед всеми другими тестами оценки экзокринной функции ПЖ: неинвазивность, низкая вариабельность, устойчивость к экзогенным и эндогенным факторам, связанным с нарушениями функции поджелудочной железы, высокая диагностическая чувствительность, в том числе и при слабо выраженных формах   нарушения функций железы. Особо следует отметить высокую специфичность и чувствительность самого метода (ELISA) определения иммунореактивной ПЭ1, который уже широко вошел в практику КДЛ стран Западной Европы и Америки (Test Kit ‘’Schebo Tech, Cbettenberg, Германия). Метод и тест-система разработаны для определения ПЭ1 в фекалиях, дуоденальном  содержимом и плазме крови человека.

Определение ПЭ1 рекомендуется проводить при абдоминальных болях, диагностике экзокринной недостаточности поджелудочной железы, в том числе сопровождающей муковисцидозы, для контроля экзокринной способности поджелудочной железы  у пациентов с эндокринной недостаточностью (диабет) и выявления пациентов с начальными стадиями панкреатической недостаточности. Референтные значения концентрации ПЭ1 у взрослых и детей (после месяца жизни) составляют более 200 мкг/г фекалий,  колебания значений в норме составляют по данным разных авторов 200-8000  мкг/г фекалий. Тест имеет специфичность равную 93 % и чувствительность – 93 %. Для анализа требуется 100 мг фекалий. В зависимости от концентрации ПЭ1 в фекалиях можно выделить стадии экзокринной недостаточности. При легкой и средней стадиях содержание ПЭ1составляет 100-200 мкг/г, при тяжелой -менее 100 мкг/г. Важным достоинством теста является возможность использовать его для определения  фермента в плазме крови при диагностике острых панкреатитов, при этом продолжительный период полужизни ПЭ1 позволяет выявить острый панкреатит даже через несколько дней после приступа. Концентрация ПЭ1 в плазме крови в норме составляет выше 3,5 мкг/мл,  для анализа требуется 1 мл сыворотки крови. Диагностическая специфичность метода – 96 %, а чувствительность – 97 %.

 

 

Таким образом, копрологический тест позволяет провести количественное определение уровня ПЭ1, отражающее степени недостаточности поджелудочной железы, а использование данного теста для количественного определения ПЭ1 в сыворотке крови дает возможность оценить уровень ферментемии при остром панкреатите.

В целом, в соответствии с современными представлениями панкреатическая эластаза может рассматриваться в качестве нового «золотого стандарта» диагностики хронического панкреатита, маркера экзокринной функции панкреатической железы и как показателя острого панкреатита.

 

Эластаза из лейкоцитов (ЛЭ) характеризуется более широкой субстратной специфичностью по сравнению с ПЭ1. Фермент  содержится в высокой концентрации внутри нейтрофильного лейкоцита,   локализован главным образом в азурофильных гранулах, а также в незначительных концентрациях в ядерной мембране, аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях. Показано, что на последних этапах развития нейтрофильного ответа лизосомные азурофильные гранулы подвергаются дегрануляции, и во внеклеточной среде оказываются мощные деструктурные протеиназы,  в том числе эластаза, освобождение которой в экстрацеллюлярное пространство наблюдается при гибели клетки, неполном закрытии фагосом, а также стимуляции дегрануляционного процесса, вызванного компонентами комплемента, хемотаксическими веществами, эндотоксинами, иммунными комплексами, Fc пептидами (через генерацию O₂ радикалов), калликреином, фактором XII и другими стимулами. Это происходит при многих заболеваниях, в том числе при нефротическом синдроме, артритах различной этиологии, остром панкреатите, перитонитах, сепсисе, заболеваниях легких, лейкозах и других заболеваниях воспалительного характера. В таблице 2 представлены основные функции  ЛЭ.

Активация лейкоцитов в кровотоке (часто на фоне примирования эндотоксинами и цитокининами) при септицемиях сопровождается их дегрануляцией непосредственно на эндотелии капиллярного русла легких, что приводит к повреждению эластиновой субальвеолярной выстилки, отеку и нарушению дыхательной функции легких. Основным повреждающим фактором считается эластаза.

Есть основания полагать, что гранулоцитарная эластаза, гидролизующая, кроме эластатина, целый спектр различных белков, в том числе многие белки плазмы крови, при секреции в кровоток будет нарушать регуляторные механизмы протеолитических систем плазмы крови, ответственных за процессы адаптации и защиты. Нарушение функций этих систем приводит к тяжелым патологическим состояниям, таким как тромбозы, тромбогеморрагии, а также диссиминированному внутрисосудистому свертыванию (ДВС). Роль эластазы в этих случаях обусловлена способностью деградировать (инактивировать) практически все компоненты этих систем. Изменение уровня факторов свертывания и возрастание количества фрагментов деградации фибриногена у пациентов с острой лейкемией и септицемией можно отнести за счет прямого протеолиза этих факторов гранулоцитарными протеиназами.

При появлении ЛЭ в плазме крови в ряде случаев имеет место ограниченный протеолиз некоторых белков, приводящий к активации последних. В частности, под действием эластазы наблюдается активация СЗ и С5 компонентов комплемента, превращение проренина в ренин.

В последнее время большое внимание привлекают данные, полученные в отношении действия эластазы на плазминоген. Эластаза отщепляет от молекулы плазминогена четыре структурных домена из пяти и формирует молекулу мини-плазминогена с активным центром, после активации которого образуется мини-плазмин. Существенным отличием мини-плазмина от молекулы обычного плазмина является уменьшение ее способности связываться с ингибиторами, что значительно удлиняет время функционирования такой молекулы in vitro и является фактором риска развития геморрагических состояний. Спектр белков, расщепляемых ЛЭ, помимо эластина, коллагена и других соединительнотканных белков, приведен на Рис.1, в центре которого показаны основные свойства ЛЭ.

 

 

Контроль за активностью эластазы в организме осуществляют плазменные и тканевые ингибиторы протеиназ. Плазма крови содержит по крайней мере семь белковых ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), составляющих около 10% всех белков плазмы крови. Среди них α₁-протеиназный ингибитор (α₁-ПИ) имеет наибольшую молярную концентрацию и играет ключевую роль в эндогенной регуляции активности лейкоцитарной эластазы. α₁-ПИ – один из основных белков острой фазы воспаления, обеспечивающий ~ 80 % антипротеолитического потенциала плазмы крови. Пристальный интерес к генетике и биологии данного ингибитора обусловлен полиморфизмом α₁-ПИ. К настоящему времени описано более 100 аллелей гена, синтезирующего α₁-ПИ. Ген α₁-ПИ  – Pi картирован на длинном плече хромосомы 14,  известна его полная нуклеотидная последовательность. Номенклатура аллелей гена Pi основана на электрофоретической подвижности продуктов этих аллелей. Ген, синтезирующий нормальную форму ингибитора, обозначается как PiМ,  нормальный фенотип как PiММ. Наиболее частым дефицитным аллелем гена Pi является PiZ, наличие которого обуславливает снижение концентрации ингибитора в крови, что ведет к развитию эмфиземы, как первично, так и на фоне хронического бронхита или другого хронического неспецифического заболевания легких. К группе аллелей с особыми свойствами относится Рi (Pittsburg). При данной мутации   продукт гена Pi приобретает свойства антитромбина III, что проявляется в манифестации геморрагических нарушений. Другим специфическим аллелем является Pi (Kalsheker-Poller). Названная  мутация не влияет на базальную экспрессию Pi-гена и концентрация α₁-ПИ  у носителей этого варианта гена нормальная. Однако при развитии воспалительных реакций не происходит повышения концентрации α₁-ПИ  в сыворотке крови.

Патологические состояния, связанные с дефицитом α₁-ПИ - распространенное наследственное заболевание. Этот белок, активно синтезируемый гепатоцитами при воспалении, когда происходит массированное освобождение протеиназ из лейкоцитов, поврежденных тканей, микроорганизмов, а также, и особенно, в случаях генетически обоснованного дефицита α₁-ПИ, может быстро расходоваться на связывание этих протеиназ и подвергаться инактивации химическими или биологическими оксидантами, табачным дымом и протеолитическими ферментами. В последствии низкий уровень ингибиторного потенциала приводит к неконтролируемому протеолизу со стороны эластазы и развитию тяжелых патологических состояний.

Кроме α₁-ПИ, эластаза связывается с α₂-макроглобулином, который подавляет ее активность менее эффективно. Другие плазменные серпины: антитромбин III, α₂-антиплазмин, С1-инактиватор и α₁-антихимотрипсин не активны в отношении ЛЭ. Более того, эластаза способна их инактивировать. Интер-α-трипсиновый ингибитор может выступать и как ингибитор, и как субстрат ЛЭ.

Активность ЛЭ находится под контролем не только протеиназных ингибиторов плазмы, но и тканевых ингибиторов, например, так называемого секреторного протеиназного ингибитора из слизистой оболочки бронхов. Все известные в настоящее время природные ингибиторы перечислены в таблице 3.

Показано, что концентрация связанной с α₁-ПИ лейкоцитарной эластазы, как правило, коррелирует со степенью тяжести травмы и наличием септицемии. Увеличение количества эластазы в плазме обычно сопровождается резким уменьшением концентрации факторов свертывания и фибринолиза, в том числе фактора Хагемана (XII фактор свертывания крови), прекалликреина, а также основных регулирующих процессы свертывания и фибринолиза ингибиторов: антитромбина III, инактиватора первого компонента комплемента (ИС1), и α₂-макроглобулина. Тромбогеморрагический синдром, ДВС и нарушение микроциркуляции во внутренних органах на фоне высокого титра комплекса эластаза/α₁-ПИ  могут стать причиной множественной недостаточности органов. Повышение концентрации комплекса также совпадает с пиком лейкопении и активацией комплемента в ходе гемодиализа. Высокий уровень комплекса эластаза/α₁-ПИ при дистресс-синдроме сопровождается  агрегацией тромбоцитов.

Таким образом, нарушение соотношения между уровнями ингибитора и активностью эластазы в пользу последней является неблагоприятным прогнозом развития ряда патологических, в том числе и критических состояний, связанных с разрушением множества функционально значимых белков.

 

Высокая протеолитическая активность ЛЭ в отношении как структурных белков, так и многих растворимых белков плазмы крови, позволяют использовать эластазу в качестве маркера патологических состояний, осложненных процессами воспаления. Поэтому определение  активности ЛЭ в плазме крови является важным показателем интенсивности процессов активации и дегрануляции полиморфноядерных лейкоцитов, степени развития воспалительной реакции и высокого риска развития тромбогеморрагических нарушений.

Прямое определение активности ЛЭ в крови и других биологических жидкостях связано с определенными трудностями, в основном обусловленными быстрым взаимодействием фермента и α₁-ПИ. В связи с этим количество ЛЭ в плазме крови обычно оценивают иммунохимическими методами (радиоиммунологическими и иммуноферментными).

Существует несколько иммунохимических методов, применяемых для определения ЛЭ в плазме крови и других биологических жидкостях: методы определения комплекса эластаза/α₁-ПИ и методы определения антигена эластазы с любым другим ингибитором или в свободном виде. Для оценки количества освобожденной нейтрофилами эластазы и ее активности предложены также иммунохимические методы определения специфических продуктов гидролиза эластазой: продуктов гидролиза фибриногена и иммуноглобулинов класса G. Иммунохимические методы, наряду с несомненными достоинствами (высокая чувствительность и специфичность), имеют ограничения в применении, наиболее важным из которых является невозможность оценки активности фермента. Для определения активности эластазы разработаны энзиматические методы. В настоящее время синтезирован ряд специфических хромогенных субстратов лейкоцитарной эластазы, но большинство из них применимы лишь для определения активности очищенных препаратов эластазы.

На кафедре биохимии Российской медицинской академии последипломного образования разработан спектрофотометрический метод определения активности эластазы, находящейся в комплексе с плазменным α₁-ПИ непосредственно в плазме крови человека. Одним из немногих синтетических субстратов лейкоцитарной эластазы, расщепляющимся в присутствии α₁-ПИ плазмы крови и позволяющим определять ее активность, является ВОС-А1а-ОNр. Другие синтетические субстраты эластазы, в частности специфический тетрапетидный хромогенный субстрат Ме0Sис-А1а-А1а-Рго-Vаl-рNА,  эластазой, находящейся в плазме крови в комплексе с α₁-ПИ, не расщепляется. Обычно определение активности эластазы, с использовани­ем ВОС-А1а-ОМр, растворимость которого в водной среде ограничена, проводят методом при конечной концентрации субстрата 0,3 mМ, т.е. при концентрации не превышающей одной Кm.

 

При разработке метода нами были подобраны условия для полного выявления активности эластазы, в том числе связанной с α₁-ПИ  в плазме крови. Состав буферного раствора, рН среды, концентрация органического растворителя и субстрата для определении эластазы в плазме крови человека запатентованы (Патент N2039983, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 20 июля 1995 г).

Показано, что эластазоподобная активность плазмы крови при патологических состояниях (перитонит, хроническая почечная недостаточность) превышает в 2-3 раза таковую активность у здоровых людей. Предложенный метод прост в выполнении, определение активности занимает 6-10 минут и не требует дорогостоящих реагентов и оборудования.

Высокая активность ЛЭ в крови больного может служить основанием для неблагоприятного прогноза тромбогеморрагических и других осложнений в связи с инактивацией ключевых ферментов протеолитических систем плазмы, в том числе прекалликреина, фактора Хагемана и их активных форм, а также других белков.

Таким образом, в настоящее время имеются веские основания рассматривать лейкоцитарную эластазу в качестве маркера острых и хронических воспалительных процессов; показателя активации и секреторной дегрануляции нейтрофильных лейкоцитов; прогностического фактора развития тромбогеморрагических осложнений, нарушения дыхательной функции легких, множественной недостаточности органов при тяжелых травмах, перитонитах и септицемиях.

Приведенные данные позволяют заключить, что интерес к эластазам, наблюдаемый в последнее десятилетие, объясняется прежде всего их активным участием в развитии различных заболеваний воспалительного генеза и высокой клинико-диагностической информативностью определения этих протеиназ при многих патологических процессах. Есть основания полагать, что эластазы выходят на уровень новых маркеров, а в ряде случаев и «золотых стандартов» при выявлении острого и\или хронического воспаления различной этиологии

                                                                             Литература.

Краева Л.Н., Позднеев В.Ф., Кокряков В.Н., Усова А.А. Лаб. дело. 1, 22-23, 1991.

Парфенкова Г.А., Оглоблина О.Г., Домба Г.Ю. Кардиология. 29, 94-96,1989.

Щутов Е.В., Доценко В.Л., Ермоленко В.М., Яровая Г.А. Вопр.мед.хим. 40(1), 38-41, 1994.

Пузырев В.П., Савюк В.Я. Пульмонология. 1, 105-115, 2003.

Borst M., Jochum M. In: Proteinases and their inhibitors. Resent developments. Abstr., 1993.

Buttle D.J. Scand.J.Clin.Lab.Invest. 50,509-516, 1990.

Dotsenko V.L., Neshkova E.A., Yarovaya G.A. Agents and Actions, Suppl. 38/11: 144-156, 1992.

Hashimoto K., Nomura K., Suzuki K., Okuyama H., Kurosawa H. J.Jpn.Assoc.Thorac.Surg. 41: 181-186, 1993.

Kramer M.D., Muller-Bardorforff M., Simon M.M., et al". J.Immunol.Methods. 131: 41-48, 1990.

Colman R. Anal.Biochem. 210: 50-57, 1993.

Tanaka H., Shimazu T., Sugimoto H., Yoshioka T., Sugimoto T. Clin.Chim.Acta. 187: 173-180, 1990.

Yarovaya G.A., Sbutov E., Jebelenko G., Dotsenko V., Neshkova E. In: Intracellular protein catabolism. 10th Inter. Conf. (Japan). Abstr. 1994.

Korkmaz B., Attucci S., Moreau T., Godat E., Juliano L., Gauthier F. Am.J.Res.Cell and Mol.Biol. 30: 801-807, 2004.

Hirche T.O., Atkinson J.J., Bahr S., Belaaouaj A. Am.J.Res.Cell and Mol.Biol. 30: 576-584, 2004.